边缘效应质控的使用说明
通常做过实时荧光PCR实验的人们可能会由于实验结果的不理想而质疑金属块热循环效果的几何不均匀性,但是,谁都拿不出确凿的经得起推敲的证据来证明此点,因为PCR的试剂决定了单管PCR实验过程是一次性不可逆的过程,也就是说单管PCR实验过程不可再重复,所以谁都不敢怀疑PCR仪器系统可能存在问题,人们更愿意将实验结果出现的问题归因于手工操作、耗材或者试剂。而我们的专利DNA检测技术——四维核酸分子杂交技术,确可以让单管检测过程再三重复,从而可以排除手工操作、耗材或者试剂的影响,检测出实时荧光PCR仪器是否存在几何不均匀性,即边缘效应。
边缘效应质控构成:用人工合成的16个碱基DNA片段以及互补的16个碱基DNA片段,一样的标准比例浓度混合后等体积放入8排管的每一个管中,并加入四维杂交试剂。 盖好盖后,将各个管可以单独分离开来。
实验安排:由于是人工合成的高纯度寡核苷酸,所以,即不需要提取核酸步骤,不会因损失率造成测量误差;也不需要扩增,不会引起核酸序列失真的现象。将4个管放入金属块的A行(或者1列),另外4个管放入金属块的H行(或者12列)对称位置,直接做熔点曲线扫描。然后对称的互换A行与H行的反应管位置,再做熔点曲线扫描。
熔点曲线程序:PCR仪器软件应当包含熔解曲线功能,具体程序要求在95ºC保持6分钟,30ºC保持6分钟,30ºC至90ºC之间用0.2ºC/秒速度连续采集荧光数据,90ºC保持0秒,然后降温仪器。
结果:如果再三对称的互换A行与H行的反应管位置,再三重复做熔点曲线扫描,得到的结果都是A行平均熔点值(Tm)比H行的平均值偏高,从未出现过H行平均熔点值(Tm)比A行的平均值高的情况,即存在边缘效应。
边缘效应的影响:实时荧光PCR仪的热循环金属块熔点温度的不均匀性会造成PCR反应过程中引物与样本核酸链杂交效率不均匀,从而造成PCR的扩增效率不均匀,由于PCR是按指数倍放大,很小的不均匀性误差经过放大就可能造成质的变化,即有可能同样成份的二份弱阳性标本,同时扩增,出来的结果可能是一阴性和一阳性。
的使用说明
通常做过实时荧光PCR实验的人们可能会由于实验结果的不理想而质疑金属块热循环效果的几何不均匀性,但是,谁都拿不出确凿的经得起推敲的证据来证明此点,因为PCR的试剂决定了单管PCR实验过程是一次性不可逆的过程,也就是说单管PCR实验过程不可再重复,所以谁都不敢怀疑PCR仪器系统可能存在问题,人们更愿意将实验结果出现的问题归因于手工操作、耗材或者试剂。而我们的专利DNA检测技术——四维核酸分子杂交技术,确可以让单管检测过程再三重复,从而可以排除手工操作、耗材或者试剂的影响,检测出实时荧光PCR仪器是否存在几何不均匀性,即边缘效应。
边缘效应质控构成:用人工合成的16个碱基DNA片段以及互补的16个碱基DNA片段,一样的标准比例浓度混合后等体积放入8排管的每一个管中,并加入四维杂交试剂。 盖好盖后,将各个管可以单独分离开来。
实验安排:由于是人工合成的高纯度寡核苷酸,所以,即不需要提取核酸步骤,不会因损失率造成测量误差;也不需要扩增,不会引起核酸序列失真的现象。将4个管放入金属块的A行(或者1列),另外4个管放入金属块的H行(或者12列)对称位置,直接做熔点曲线扫描。然后对称的互换A行与H行的反应管位置,再做熔点曲线扫描。
熔点曲线程序:PCR仪器软件应当包含熔解曲线功能,具体程序要求在95ºC保持6分钟,30ºC保持6分钟,30ºC至90ºC之间用0.2ºC/秒速度连续采集荧光数据,90ºC保持0秒,然后降温仪器。
结果:如果再三对称的互换A行与H行的反应管位置,再三重复做熔点曲线扫描,得到的结果都是A行平均熔点值(Tm)比H行的平均值偏高,从未出现过H行平均熔点值(Tm)比A行的平均值高的情况,即存在边缘效应。
边缘效应的影响:实时荧光PCR仪的热循环金属块熔点温度的不均匀性会造成PCR反应过程中引物与样本核酸链杂交效率不均匀,从而造成PCR的扩增效率不均匀,由于PCR是按指数倍放大,很小的不均匀性误差经过放大就可能造成质的变化,即有可能同样成份的二份弱阳性标本,同时扩增,出来的结果可能是一阴性和一阳性。