分子与细胞

RealTime PCR技术服务

基本信息
服务名称:
RealTime PCR技术服务
英文名称:
RealTime PCR技术服务
参考报价:
总点击数:
3427
更新日期:
2009-09-15
服务类别:

服务详情
RealTime PCR技术服务

荧光定量PCR概述

  聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展,定量PCR技术取得了突飞猛进的发展,实时定量PCR (real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术。所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量。

  目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域,仅2000-2001年,收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达1000多篇。实时PCR技术较之以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先,它不仅操作简便、快速高效,而且具有很高的敏感性和特异性。其次,由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。

  实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因芯片,siRNA干扰的实验结果。 

  Sunbio为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务,全部实验皆使用进口试剂完成,定量PCR仪器为Corbett Research 公司生产的离心式实时定量PCR仪Rotor-Gene 3000。


(以上图片由SUNBIO生命科学实验中心数据库提供。未经允许不得转载!)


荧光定量化学原理介绍
☆TaqMan荧光探针
  PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图所示。

SYBR Green荧光染料
  SYBR Green是一种DNA结合染料,能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下,它不发出荧光,但一旦结合到双链DNA中以后,便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合,用于任意反应体系中。从经济角度考虑,它也比其它的探针的价格要便宜得多。但由于它能与所有的双链DNA结合,所以一旦反应体系中出现非特异扩增,那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素,可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。

荧光定量PCR中的一些术语
1. CT:荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数,或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。


2. 阈值:阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。


3.CT值与起始模板的量成线性关系,数学原理如图所示:



●主要实验步骤如下

1. 设计并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR® Green)的PCR反应的优化。
3. 客户样品RNA抽提
   实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。
实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA
4. RNA质量检测 
a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度
b. 使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
5. 使用逆转录酶(Promega)进行反应,将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品:
进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司),进行RealTime PCR扩增和检测。
8. 检测结果进行标准曲线分析:以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 提供实验报告:包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表 

●实时定量PCR全套技术服务收费标准
☆实验步骤
1至9个标本10个标本以上
组织或细胞RNA抽提
RNA质量检测
cDNA制备  300元(一个组织或细胞标本) 270元(一个组织或细胞标本)
目的基因实时定量PCR
看家基因实时定量PCR
标准曲线制备
数据分析   200元(一个标本一个指标)
标准曲线制备及看家基因内参免费 180元(一个标本一个指标)
标准曲线制备及看家基因内参免费 

☆全套技术服务
您只需提供组织或细胞标本,我们为您完成RNA抽提,cDNA制备,实时定量PCR,标准曲线制备及数据分析的所有步骤。
标本的运输费用及引物合成费用客户自理
如需制作PCR电泳效果图,每张(1至9个标本一张)收取100元
公司简介

尚柏生物医学技术(北京)有限公司创建于2000年,已经获得国家经营三类医疗器械许可(证号:京081876)和北京市科学技术委员会认定的高新技术企业(统一编号:0611008A21672)。公司总部位于高校云集的北京市海淀区中关村科技园区,座落于中国铁路建设总公司铁建医院。与军事医学科学院、301医院、305医院等国内外知名的科研单位和医院紧密为邻。2007年7月11日,SUNBIO正式被北京中医药大学授权为"国家基础医学与生命科学人才培养实训基地",SUNB IO不断积累和总结实习带教经验,使学生的理论知识和人生阅历通过SUNBIO这个平台得到实践和丰富。SUNBIO将不断加强实训基地的基础设施和人才队伍的建设,逐步完善实习教学模式,争取成为更多基础医学、生命科学教学示范单位的人才培养基地。

尚柏生物致力于尖端免疫学和分子生物学技术在科研中的应用与推广,专业从事免疫检测及其他相关产品的引进、服务和研发。目前已经拥有自主知识产权专利产品6项。尚柏生物公司是一家深受客户信任的高质量服务供应商,通过高度细分、全方位的服务平台,向生物制药和医疗仪器公司提供生物医学产品测试,合同研究及开发,以及生物 cGMP 生产服务。

SUNBIO生命科学实验中心作为尚柏生物的核心技术平台,由加拿大籍华人投资人民币800万元,拥有专业的实验室、洁净的动物房和一流的实验设备(实验室总面积达200平方米拥有仪器设备20余台,较大型仪器设备有:荧光定量PCR仪器、CO2培养箱、超低温冰箱、荧光显微镜、高速冷冻离心机、PCR仪、垂直电泳仪、自动生化分析仪、紫外分光光度计、酶标仪、超净工作台等)和经验丰富的技术人员,其中助理研究员(博士)4人,实验师(硕士)12人,已经发表的SCI文章6篇,国家核心期刊文章20余篇,完整的实验记录多达5000多份。科研项目涵盖临床医学、免疫学、细胞生物学、分子生物学等生命科学诸多领域,具体的实验方法有:普通PCR、荧光定量PCR(real-time PCR)、Western印迹、流式、ELISA、免疫组化、细胞培养、MTT、放免、实验动物饲养及造模等。同时本实验室人员有丰富的新药研发企业工作经验,能够承担新药药效学及毒理学实验,提供新药申报资料、文献查询及综述内容的整理服务。

SUNBIO生命科学翻译中心作为尚柏生物旗下全资子公司,专门从事医学、医药类口笔译的专业化翻译公司长期以来,SUNBIO翻译中心为卫生部、药品监督管理局下属多家单位及多家著名跨国医药企业提供口、笔译服务,获得一致好评。SUNBIO翻译中心以国内知名医科、药科院校,科研院、研究所翻译专家、教授,医学博士,药学博士及外籍(美、英、德、日、韩等)专家为主要依托,云集国内中西医专业翻译人才,以及国外留学回国人员,致力于国内外中西医基础理论、医疗、制药、生物技术、医疗器械、化妆品、食品卫生、兽医等医药相关行业的专业化翻译服务。SUNBIO翻译中心可提供英、日、韩、法、德、俄、意、西班牙等十余种语言的口译、笔译服务。SUNBIO翻译中心坚持奉行“专业、严谨、快捷”的宗旨,凭借装备精良的专业化翻译队伍,以SUNBIO严谨的作风,为客户提供快捷、足不出户的翻译产品和服务。SUNBIO翻译中心视质量为企业生存之根,效率为生存之本,按照GB/T19002-1994 idt IS9002:1994 标准的要求,建 立了先进的质量管理体系和内部管理制度,并全面运用全球最先进的塔多思(TRADOS)翻译记忆软件,以及Freehand、Pagemaker、CorelDraw等制图排版软件,竭诚为海内外广大客户提供最佳的专业化翻译产品和高品质的翻译服务。

公司充分依托装备精良的研究平台,结合自身的技术优势和精良的人力资源,始终不懈的跟踪生命科学领域发展的最前沿。目前,公司承担众多科研院校的国家863、973等科研项目的技术服务,通过我们的高效服务,全国众多客户在EJP, JBC等杂志上发表了影响因子较高的SCI论文。协助近百名研究生进行科研选题和课题合作服务,这些研究生在毕业答辩时都获得了答辩组专家好评,其中一位已获得全国优秀博士论文荣誉。

我们所做的一切都是为了使您的工作更轻松、更快捷。良知使我们不断拿出和引进更好的产品,控制和降低各种成本,为您的研究加油,加速我国自有成果的开发,最终摆脱对进口产品的依赖。这是一项长期艰苦的工作,这是一项光荣伟大的工作,这是我们继续发展的动力。


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