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植物基因编辑（CRISPR/Cas9） 技术服务
技术简介
CRISPR 体系是存在于细菌和古细菌中的一种获得性免疫系统， 经过改造成
为一种高效的基因编辑工具， 可以在基因组水平上对 DNA 序列进行编辑。 原理
是 guide RNA 通过碱基互补配对识别靶位点并且引导核酸内切酶 Cas9 对靶位点
进行精确剪切， 随后细胞的自我修复机制造成了靶位点编辑， 即敲入或敲除。 目
前国内外研究人员已经运用 CRISPR/Cas9 系统实现了对人类细胞、 动物、 植物
和酵母等多个物种的基因编辑。
河南密码子公司以农杆菌介导的植物遗传转化体系为支撑， 构建了能同时表
达 Cas9 和多个 sgRNA 的双元载体， 适用于双子叶植物的基因敲除， 如拟南芥、
烟草、 番茄、 棉花、 西瓜等。
应用范围
1、 未知功能基因的研究
通过 CRISPR/Cas9 技术敲除未知功能基因， 创造突变体材料， 观察突变体和
野生型的表型差异， 该技术为深入研究未知基因的功能提供了良好的方法和材
料。
2、 已知功能基因的运用
利用 CRISPR 技术对已知功能基因进行敲除、 修饰， 使植株获得抗性或者更
优的性状， 此种技术可以为育种创制新材料， 也能够加快育种进程， 提供新品种。
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技术优势
1、 Crispr/Cas9 基因编辑技术相对于 ZFN 和 TALEN 简单易操作， 基因敲除效率
高且成本低。
2、 本公司有双子叶植物的 CRISPR/Cas9 载体和成熟的烟草遗传转化体系。
3、 针对客户的目的基因， 可一次设计 2 个 gRNA 靶点构建载体， 提高基因敲除
效率。
4、 本公司使用 ClonExpress®技术， 无须中间载体， 一步将目的片段和载体无缝
拼接。
实验流程
CRISPR-Cas9 技术的应用主要包括以下几个关键步骤（如图） ：
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技术服务

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备注：
1. 客户可以提供构建好的 CRISPR/Cas9 载体， 也可委托该公司构建； 公司提供
CRISPR-gRNA 载体构建服务， 您只需提供靶位点序列， 即可为您合成并克隆至
您指定的任何载体中。
2. 上述植物转化收费标准为该公司推荐的植物品种， 客户如指定转化品种， 双
方需另行协商， 并增加预实验。
3. 合同签订要先于项目启动， 项目会在确认收到客户寄送的生物材料后的 5 个
工作日内启动， 实验顺利开展后， 客户需支付预付款， 项目结束前的 15 日内需
支付剩余款项。
4. 客户可以筛选服务项目、 也可提出个性化要求， 双方协商确定技术方案和费
用；
5. 每 1-2 个月向客户提交项目报告， 包含
1） 项目进展报告
2） 载体构建的电泳图片和和测序结果
3） 外植体侵染、 愈伤诱导、 胚性愈伤、 出芽生根情况、 植株再生等图片
4） T0 代植株 Cas9 基因 PCR 检测电泳图片
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目的基因 CRISPR 靶位点选择的网站
http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR
http://cas9.cbi.pku.edu.cn/
http://www.rgenome.net/cas-offinder/
※ 靶位点区域选择：
获得目的基因的完整基因组序列和 CDS 信息， 找出基因的外显子序列和位
置， 确定靶点的大致位置。 一般情况下靶点应靠近翻译起始点， 均置于外显子区
域， 且选定区域 GC 含量最好在 40%~60%。
※ 靶位点的设计原则：
（1） 载体含有转录起始位点 G， 靶点序列长度 18~22bp， 一般设为 19bp；
（2） 靶点在基因组正负链上都可， 方向为 5’-3’， 在 3’末端必须有 NGG；
（3） 选择靶点时应包含 3’端 NGG， 构建载体引物时， 不应包含 3’端 NGG；
（4） 靶点序列相对特异， 避免在靶位点 3’端多联 T 碱基；
（5） 靶点序列应在基因组数据库中进行比对， 避免脱靶；
（6） 靶点 5’端 8-19 位的碱基不能有错配， 例如选取的靶位点为 N1-N19，
5’-N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19-NGG-3’
N8-N19和目的基因匹配时不能有错配， N1-N7 可以允许有 1 个碱基的错配，
但整体靶位点能够匹配的序列不能少于 18bp。
CRISPR/Cas9 植物基因敲除载体
CRISPR/Cas9 植物基因敲除载体可以敲除双子叶植物基因的单位点和双位点：
Table1.CRISPR/Cas9 植物基因敲除载体组分列表

pHSD4.1 可以用来直接构建一个靶位点的载体。
pHSD4.1 和 pUC57-T1T2 两个载体可以构建两个靶位点的载体， 操作简单。
购买我们的载体可免费提供一份详细的载体使用说明书。
※ 贮存条件
短期保存， 请在载体至于-20℃保存， 避免污染； 若长期保存， 请转化大肠杆
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菌， 并使用甘油菌保存。 pHSD4.1 为卡那霉素抗性， pUC57-T1T2 为氨苄抗性。
※ 载体图谱：
pHSD4.1
pUC57-T1T2
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载体构建的选择
※ 基因合成和亚克隆
您可以提供载体和基因序列， 并指定酶切位点， 我们根据您提供的信息合成
序列并亚克隆到您指定的任意载体上， 且多个载体构建可同时进行， 周期固定为
3 周。
※ 优势： 省去 PCR 扩增、 载体酶切和连接、 测序的步骤， 也省去了试剂耗材费
用， 更能为您节省时间， 交付质粒冻干粉、 甘油菌和一份详细的检测报告， 您可
放心使用。
基因合成和亚克隆价格表

欢迎垂询！ 咨询电话： 0371-63689755 咨询 QQ： 2110312070
※ 自主完成载体构建
CRISPR 载体构建需要的试剂耗材
货号 名称
PE102-01 高纯度质粒小量提取试剂盒（离心柱型）
CC102-01 DH5α感受态细胞
PR112-01 KOD DNA Polymeras（with HighPure dNTP mix )
CV116-01 T4 DNA Ligase
PR121-01 2×Taq PCR MasterMix (with Dye)
CV106-01 一步法无缝克隆试剂盒（单片段克隆）
CV107-01 无缝克隆拼接试剂盒（单/多片段克隆）
BsaI 限制性内切酶
GV3101 感受态细胞
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遗传转化的步骤和试剂耗材
※ 烟草遗传转化的步骤主要有：
农杆菌侵染和共培养→诱导外植体出芽→诱导生根→成苗
※ 遗传转化必备的试剂耗材：
试剂 耗材
MS 培养基（sigma） 手术刀柄
6-BA 手术刀片
NAA 枪型镊
IBA 直径 12cm 玻璃培养皿
蔗糖 200mL 玻璃组培瓶
植物凝胶 Phytagel 2L 锥形瓶
潮霉素 B Roche 100mL 锥形瓶
硫酸卡那霉素 50mL 离心管
噻孢霉素 封口膜、 封瓶膜
组培中用的试剂如 MS 培养基、 植物激素和抗生素等， 都对外植体的生长和分化
有重要影响， 我公司为各位奋斗在一线的科研工作者提供 sigma 的原装正品， 能
保证试剂的品质和质量， 让您少走弯路， 为您节省时间。
Cas9 阳性苗的检测
阳性苗的检测使用公司自主研发的直扩试剂盒， 只需要取少量植物组织（芝麻粒
大小） 就可直接检测是否存在目的基因。
DT103-01 植物 PCR 直接扩增试剂盒
※ 优势：
1、 省去了提 DNA 的繁琐步骤和时间
2、 不伤害转基因苗， 不影响苗的正常生长
3、 结果准确可靠， 直接用新鲜组织提取， 不会因为 DNA 的降解而影响实验。