腺相关病毒载体概述

　　腺相关病毒（AAV）是一种复制缺陷型细小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组人腺相关病毒。这种系统利用已经明确与调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且将这些基因产物通过转染引进宿主细胞。在AAV Helper-Free System中，生产具感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VA RNA 基因）大部分由与其他质粒共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是经过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。由于不再需要活的辅助病毒，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。

　　腺相关病毒用于基因传递和表达的优势

　　1) 宿主细胞范围广

　　腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞并且以成功应用于人源和非人源蛋白的表达，宿主细胞活跃的分裂不是感染的必要条件，重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞。

　　2) 长期的基因表达能力

　　重组AAV能保存于人类宿主细胞中，保持长期的基因转录表达能力，对于终末分化的细胞这个优点特别明显。

　　3) 低免疫原性

　　与已获得临床应用的腺病毒载体相比，AAV在注射后引起的免疫反应是微弱并且短暂的。

　　4) 良好的扩散性能

　　AAV的病毒粒径只有腺病毒的1/5，慢病毒的1/4，体积上相差数十倍到100倍，所以AAV的扩散性远高于这两种病毒。

　　5) 较高的生物安全级别

　　AAV是天然缺陷型病毒（生产性感染依赖于几个额外的反式因子），并且目前还没有发现它和任何的人类疾病有关联。在AAV Helper-Free System中，AAV反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，以阻止生产出重组野生型病毒。这样特征赋予了作为病毒来源的基因传递和表达系统的AAV Helper-Free System一个较高的生物安全级别。

腺相关病毒颗粒生产包装

　　生产流程示意图

　　实验步骤

　　第一步：是把外源基因克隆进合适的载体。 大多数情况下，外源基因被克隆到一个包含ITR/MCS的载体中（pAOV.SYN.GFP或类似载体，以下的说明中以pAOV.SYN.GFP为例）。这些载体中反向末端重复（ITR）序列提供所有AAV复制和包装必须的顺式作用元件。

　　第二步：重组表达质粒同pHelper（携带腺病毒来源的基因）和pAAV-RC（携带AAV复制和衣壳基因）共转染进AAV-293细胞（提供AAV复制和包装所需的反式作用因子）。转染2到3天后重组AAV在包装细胞中组装完成。

　　第三步：从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒，一般AAV颗粒会富集在包装细胞中，所以收集细胞而后裂解释放AAV颗粒到上清中可以回收大部分的AAV颗粒。这一步得到的病毒上清液随后用于感染各种哺乳动物类细胞系的感染实验。同时上清中的病毒也可以浓缩保留。

　　第四步：浓缩并纯化第三步的病毒上清液，原上清液里面包含了许多细胞蛋白分子和碎片，通过2次CsCl密度梯度离心和1次超滤可以去除绝大部分的细胞蛋白和残留的CsCl离子。动物实验都需要纯化后的病毒才能够进行，否则会达不到所需剂量并引起副作用。感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒。这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷（喜树碱或丁酸钠）来加速。然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。

　　第五步：用定量PCR法测定所得到病毒的滴度，这种方法可以得到被包装到颗粒中的AAV基因组的物理滴度值。AAV的感染滴度值因为感染细胞、AAV外壳蛋白和测试条件不同有很大差异，并且体外的实验数据不能反映体内的感染情况，所以在比较AAV时，定量PCR得到的物理滴度值是一个更客观的数值。 

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