Cas9-Cell line Knock-In service（Cas9-CKI）基因定点敲入细胞系是Cas9X技术团队针对实验室常用的各种细胞系，研究并确立针对不同的细胞的外源基因或者片段高效敲入（Knock-in, KI）的技术操作规程，主要目的就是：解决KI效率低下和KI片段长度限制的问题。

目前使用Cas9的进行基因KI研究方法，主要应用在目的基因后面加上标签，对目的蛋白进行定位；再有就是通过对小鼠细胞的目的基因进行修饰替换成为人的基因，用于动物的CDX模型等。KI实现的方案包括：使用合成的Oligo或者ssDNA（single-stranded DNA，ssDNA）作为“Donor”来实现长片段的敲入；也可以通过AAV病毒的方式（其病毒以ssDNA的方式存在于细胞核中）导入ssDNA作为“Donor”载体，也可以通过dsDNA片段或者环状质粒作为“Donor”来实现KI的目的。

但是不同的细胞模型KI的效率依然不能令人满意，且不同的细胞系之间的效率差异很大，很多细胞无法实现定点的KI。 Cas9X针对不同的片段的长度和不同的细胞特性使用不同的KI策略：小的片段使用Oligo进行KI，再长一点的使用ssDNA进行KI，如果长度超过1Kb的将使用重组的办法进行KI。针对细胞系的KI效率非常低的，需要先构建Cas9稳转细胞株再进行gRNA和Donor的转染来提高KI效率。Cas9X努力优化实验条件满足不同细胞系和不同片段长度的KI服务需求。

Cas9X将为你的细胞探索优化的KI实验方案。

|   技术原理图

|   技术流程图

|   基因敲入项目名称

构建eGFP基因敲入的人胶质瘤细胞细胞
 
实验设计

种属：Human； 基因名称：PRNP
gRNA位点：ATCTTCCTGATAGTGGGATGAGG
Donor载体：5'arm-eGFP-3'arm
 

细胞信息

种属：Human； 细胞名称：人胶质瘤细胞U251
培养基：DMEM，10%FBS
 
细胞检测

无菌检测：合格； 支原体检测：合格
细胞克隆形成率检测：细胞增殖能力较好，克隆形成率较好。
细胞基因型检测：针对gRNA打靶位置及其附近基因组序列进行测序。测序结果与理论序列一致。
 
细胞转导                                                           

电转参数：1005V，35ms，2次； 电转体系：10 uL
 
PCR筛选

筛选克隆数量：160； 阳性数量：10
电泳图示例：

 
克隆状态

1.  Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013).

2. Sojung Kim, D.K. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 10.1101/gr.171322.113 (2014).
3. Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biol. 2017;18(1):92.
4. Kan Y, Ruis B, Takasugi T, Hendrickson EA. 2017. Mechanisms of precise genome editing using oligonucleotide donors. Genome Research 27, 1099–1111.