CO-IP
服务详情
1、蛋白提取
1）贴壁细胞总蛋白提取：
用PBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次，最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。
2）悬浮细胞总蛋白提取：
低速离心收集细胞，加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬，2000rpm离心10 min，吸除上清。重复以上操作两次，收集细胞沉淀。加入适当体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。
3）组织总蛋白提取：
组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。
① 配制分离胶（见附录1），加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面，约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。
② 配制浓缩胶（见附录2），加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
③ 拔出梳子，将电泳架放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，将样品加入点样孔中。
④ 按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿。
2）按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构，从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵，摆放过程中要除尽各层中气泡。
3）按300mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。
2）除去封闭液，加入已稀释好的一抗4℃过夜。
3）回收已稀释的一抗，用TBST洗三次，每次5min
4）加入稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗四次，每次5min。
2）根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。
1）贴壁细胞总蛋白提取：
用PBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次，最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5mL离心管中。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。
2）悬浮细胞总蛋白提取：
低速离心收集细胞，加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬，2000rpm离心10 min，吸除上清。重复以上操作两次，收集细胞沉淀。加入适当体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。
3）组织总蛋白提取：
组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保匀浆液完全裂解。4℃12000rpm离心5min，收集上清，取上清1/10作为Input，剩余样本做IP。
- 蛋白浓度定量
- 磁珠预处理
- 裂解液预处理
- IP过程
- 取以上相同量细胞裂解液或者组织裂解液上清1到1.5ml离心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）抗体沉淀两种相互作用的蛋白质中的一种（同时加相同量的与用于沉淀的抗体种属来源相同的普通IgG作为阴性对照，阴性对照实验），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg沉淀抗体，具体沉淀抗体加入量根据IP级抗体使用说明书进行稀释）。
- 再加入20μl磁珠（使用前充分混匀），用手指轻轻弹匀，4℃摇转孵育过夜；
- 将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清（尽量避免碰到磁珠）。
- 加入适当体积的Washing buffer 于离心管中，置于垂直摇床上洗涤3min后，将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清（尽量避免碰到磁珠）。
- 重复④操作3次。
- 最后一次洗涤之后，小心弃去上清后，加入适当体积 2×SDS含巯基乙醇的上样缓冲液，沸水煮10min，样本置于-20℃保存。
- SDS-PAGE电泳
① 配制分离胶（见附录1），加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面，约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。
② 配制浓缩胶（见附录2），加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
③ 拔出梳子，将电泳架放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，将样品加入点样孔中。
④ 按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝到达胶板下沿。
- 转膜
2）按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构，从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵，摆放过程中要除尽各层中气泡。
3）按300mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。
- 抗体孵育
2）除去封闭液，加入已稀释好的一抗4℃过夜。
3）回收已稀释的一抗，用TBST洗三次，每次5min
4）加入稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗四次，每次5min。
- 化学发光检测
2）根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。
- 结果分析
公司简介
武汉恒意赛生物科技有限公司坐落于武汉光谷国际生物医药产业园，拥有独立的细胞培养室以及SPF级动物房，致力形态病理学、细胞生物学、分子生物学、蛋白免疫学、模式动物等在科研中的推广和应用，专业从事分子、蛋白、细胞领域相关产品的引进和研发。自成立至今，公司团队成员已参与了多个医学生物研究课题和国家自然科学基金、项目。以多年科研立项、评估、科研转化的经验，为广大科研工作者的课题提供专业的服务，并与全国多家企业以及科研机构建立合作关系为每一位科研工作者提供最优质、最高效的实验服务。
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