毕赤酵母表达系统介绍

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

GS115：AOX1和AOX2基因都正常表达AOX蛋白（乙醇氧化酶），甲醇的利用率高，接近于野生型，属于甲醇快速利用型（Mut+）

KM71：AOX1基因被大部分剔除，只能利用AOX2为AOX编码，甲醇的利用速率变慢，表现为甲醇慢利用型（Muts）

外源基因的整合方式不同会导致表达菌株的表型不同：

菌株表型

载体信息

对于胞外表达的蛋白除了可以用载体自带的信号肽，还有以下信号肽可供选择：

信号肽序列

1. 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。

2. 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。

3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。

4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

1. 具备完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户的需求设计不同的实验方案；

2. 具有高通量的筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件；

3. 具有大规模发酵生产能力

表达载体pPIC3.5K（胞内表达），目的蛋白32.49KD（理论值）

表达菌株：GS115/KM71

诱导条件：甲醇浓度0.5%/1%，诱导时间24h/48/72h

结果分析：从SDS-PAGE胶图中可以看到，目的蛋白（糖基化后40KDa左右）有明显表达，其中GS115-5#-24h，0.5%甲醇，GS115-2#-48h，1%甲醇，GS115-3#-48h，01%甲醇，KM71-1#-72h，1%甲醇，都有很明显的目的条带，目的蛋白成功表达。