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大肠杆菌表达纯化服务-原核蛋白表达

基本信息
服务名称:
大肠杆菌表达纯化服务-原核蛋白表达
英文名称:
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162
更新日期:
2023-09-28
服务类别:

服务详情
原理简介

  大肠杆菌表达是指通过基因克隆技术,将外源目的基因导入表达菌株,使其在特定条件下进行表达。与其他表达系统相比,大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强、更易于生长和控制,有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具有各种特性的质粒可供选择等优点。
  E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、渗透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。
  在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录启动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用与异乳糖相同,是一种作用很强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

实验流程

  1、原核表达载体构建:目的基因克隆或目的基因合成;限制性内切酶酶切骨架载体并纯化;目的基因插入骨架载体;转化大肠杆菌,筛选阳性克隆并测序鉴定;
  2、转化表达菌株:针对不同的表达载体选择合适的表达菌株,将目的载体转化到表达菌株内,例如:BL21 (DE3);
  3、蛋白诱导表达条件摸索:优化目的蛋白表达条件:IPTG浓度,诱导表达时间,诱导表达温度等;SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测;
  4、扩大培养:选择更佳的诱导表达条件扩大培养物;
  5、制备表达菌株蛋白提取物:超声波破碎菌体或者高压破碎菌体;
  6、目的蛋白的纯化:亲和纯化;SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western Blot检测。
 

服务优势

  服务周期短;
  目的蛋白纯度高;
  目的蛋白可溶性高;
  多种表达菌株以及载体可供选择;
  团队经验丰富

 
 
公司简介
安徽中科圣安生物技术有限公司总部位于安徽省合肥市,核心团队成员由分子生物学、免疫学、细胞学等领域的博士硕士组成,由在国内科研领域有着多年从业经验的专业技术团队和企业管理团队组建而成,中科圣安生物一直秉承着“以人为本、诚信与品质”的发展理念。   中科圣安生物立足于生命科学,为基础生命科学研究领域的科学工作者提供生物学先进技术服务,公司以TurboID邻近标记(Proximity labeling, PL)技术为核心基础,致力于为科研工作者定制目标蛋白质互作网络数据库,为系统地解析蛋白质的功能,揭示生命体的奥秘提供了有力且可靠的技术支持。   同时,公司依靠自身的优势,还为科学工作者提供分子生物学技术服务,主要业务包括:酵母双杂交一对一互作验证;GST下拉实验(GST-pull down assay);免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,co-IP);双 分 子 荧 光 互 补 实 验 ( Bimolecular fluorescence complementation, BiFC);荧光素酶互补成像技术(Luciferase complementary imaging,LCI);凝胶阻滞实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA);亚细胞定位(观察蛋白的定位情况);TurboID邻近标记技术构建蛋白互作网络数据库等等。

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