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实验离心技术新进展

2008-12-30     来源:本站     点击次数:5798

引言

实用离心技术可分为二大类:一类是用于化工、制药、食品、污水处理、油品处理。工业的大型制备用离心分离技术,所使用的离心机及其附件属于大中型工业生产设备。其中管式离心机转速较高,小型可达50,000rpm,较大型(每小时处理量在1.5 吨以 上)也可达15,000rpm(国外典型机如Sharples,国内如上海离心机研究所GQGF 系列);转筒式离心机广泛用于乳品,油品,工业废水处理,最大处理量可达90 /小时转速从每分钟数千至数万转。(国外典型机多为α-Lavalwestfalia 等牌号);转鼓式工业离心机(广泛用于制药、食品如Krausaffai 等);卧式螺旋卸料离心机(最高转速5000rpm,最大处理量10 /小时,国外如Westfalia,国内如上海离心机研究所的LW 系列);以及转速在3000rpm 以下的三足离心机等等。另一类是用于生物、医学、化学、农业食品及制药等试验室研究、中间试验、部分生物制药行业的小批量生产的实验离心技术。目的在分离和纯化样品(特别是生物体组份)并对样品的某些特性进行分析。后一类离心设备的转速从每分钟数千转到每分钟十多万转,每次实验处理的样品量较少,但其设备由于转速高(目前最高达 150000rpm),离心力大(目前已达1050000×g)对转速、温度、真空、离心程序、模拟方 法等要求高而使这类离心机构造复杂、并在机械制造、电子电器控制、制冷系统、真空系统、防护设备、转头及附件制造等各方面都保持着很高的技术与工艺水平。实验离心方法由于样品的分离要求各不相同以及为适应现代生物医学研究的快速发展而形成了比较完善和具有 一定独立性的实验技术学科。
      实验离心技术是一个比较年轻的学科。最早使用手摇离心机进行食品(比如奶酪生产),血液分离可以追溯到十九世纪;电动低速台式离心机的商品化始于1912 年;离心技术的奠 基人在实验离心技术方面开拓性的工作创始于1920 年代;而高速、超速离心机的商品化生产、实验离心技术的普遍应用则是从上世纪五十年代开始的。 现代工业的进步,促进了离心设备的开发,也有利于各种样品(特别是生物体组份)离心分离方法的迅速推广和应用。而现代生物医学研究的进展和对研究、诊断手段的大量需求而使离心机生产行业欣欣向荣。二十世纪70 年代以后,低速、高速、超速离心机产品几经更新 换代。目前,先进的超速离心机已经能够产生相当于重力加速度100 多万倍的离心场并能保 持此离心场连续运转数十小时以上;新一代的超速离心机还能对各种生物样品离心方法进行 模拟,以找到最佳的离心分离方案和进行诸如分子量、沉降系数的计算。最近几十年在离心方法方面的研究成果使我们可以利用那些较为先进的离心设备完成绝大部分生物体组份的 分离和纯化。

简史:

综观近年来实验离心技术的进步,可把一些重要事件分列如下:
1911~1912
年:开始生产和使用低速(3,000rpm 以下)的商品化台式离心机。(IEC 1923~1926 年:瑞典UPPSALA 大学以Svedberg 为首的科学家试制了世界上第一台试验型超 速离心机,45,000rpm,油透平驱动,不锈钢小转头,转头置于H2 浴中,1926 年开始运转。
1929
年:Lamn 完成了沉降方程。计算了沉降速度。定义了沉降系数。
1932 年:细胞核的离心纯化(Behrens
1933 年:BeamsPickels 研制成试验型空气透平驱动超速机。
1934 年:Bauer 用以上离心设备成功分离出黄热病病毒。 Bensley 等纯化了线粒体。
1940 年:Svedberg Pederson 出版了超速离心一书(文献(1))概括总结了在此之前近20 年的研究成果,奠定了离心技术的理论基础,Svedberg 被公认为实验离心技术的奠基人,他因这方面的成就而获得诺贝尔奖。
1940~1950:开始研究用于制备超速离心机的速率——区带(Rate-Zonal)密度梯度离心法和用于分析超速离心的沉降速度法。(文献(2))
1943
年:Pickels 研制成现代固定角式离心转子。(文献(2))
1951 年:Brakke 第一次发表了他对速率
区带密度梯度离心法的研究成果,并在1960 年再次对这一方法作了综合评述。(文献(4))1951 年:Kahler 研制成功甩平(Swing-out)转子。(文献(5))
1946~1954 年:世界各主要离心机生产厂开始研制并准备商品化生产离心机。
1955
年以后:开始了超速、高速、低速大容量离心机以及分析用超速离心机的商品化生产。
1957
年:Meselson
1959 年:Duve 等开发了等密度离心法。(6)(7

1964~1966
年:Anderson 等开始建立转子区带离心技术并开发了低、高、超速区带转头 (MSE)。在此基础上,各种转速的连续流离心分离也逐渐被利用和完善。(8

1959
年:干涉光学系统(Richard 等),吸收光学系统(Nichols,)等方法被用于分析超 离心技术。(9)(10
1975 年:垂直管转子被开发并用于Dupont-Sorvall 油透平驱动的超速离心机。

1980
年:美籍华人B.H.Chung 等发表了血清脂蛋白的单次垂直管分离法的研究成果, 被学术界及医学临床应用至今。(11

1981
年:美国Beckman 公司开发的用于细胞离心纯化的
淘洗转头(Elutriation rotor)供应市场。
1980
年代:由于各种新的分离方法的开发(如HPLC 等),分析超离心方法及设备开始 走下坡路。但近年来随着大分子量(>500000)样品研究的需要,分析超离心又有卷 土重来之势。 1980 年代:在激烈的市场竞争中德国Heraeus 公司及英国MSE 相继停止了超速离心机 的生产。 1980 年代:为了适应大分子利用重金属盐等作等密度离心的需要,利用计算机优化设 计的部分转头对样品密度的要求(在最高转速时)由1.2g/cm3 提高到1.7 g/cm
3
1984 年:由D.Rickwood 等编著的Centrifugation
一书出版,对离心技术的各方面作了比较全面的论述。
1992
年:
Centrifugation再版,增加了制备超速离心的计算机模拟计算并对生物大分 子的最新离心方法作了总结。(12
1990
年代:各种离心机开始全面使用变频电机直接驱动,超速离心机开始安装半导体制冷元件。

2001
年:实验超速离心机最高转速达到150000rpmRCFmax 突破105 万×g 大关。 超速离心机开发了专用模拟软件并与PC 机联用。 近期:日立开发了无比例保修十年的新型悬挂式驱动部,各种离心机开始装用高亮度、大屏幕、多功能液晶显示屏,超速离心机转头的寿命自动管理和自动延长系统投入使用。

最主要的离心机制造商:
美国:
·Beckman(现已与Coulter 公司合并为Beckman-Coulter

·Sorvall(早期为Dupont Sorvall 后独立为Sorvall 现已与德国Heraens 公司、CARR 公司和Jewett 合并为Kendro,现属于ThermoElectrom集团。

·IEC(老厂,以生产中、低档产品为主)现也属于ThermoElectrom集团。
日本:

·HITACHI KOKI(日立工机)

·Kubota(久保田)

·Tomy(精工)
 
·Kokusan(国产)

英国:

·MSE(老牌厂,80 年代后数年几近停产,1990 年被日本Sanyo 公司收购定牌为Sanyo-MSE,近年来又开始生产离心机)

德国:

·Heraeus(现已与Sorvall 合并为Kendro,现属于ThermoElectrom集团)

·eppendorf(台式机)

·Sigma(小型机为主)

·Hettich(台式机为主)

·Hermle(小型机为主)

瑞士:

Kontron
(目前已从中国市场隐退)

法国:

Jouan
(高速以下,现属于ThermoElectrom集团)

目前国际市场上最先进的机型:

·超速离心机

(美)Beckman-Coulter Optima XL-AXL-I 分析超速机型 Optima L 系列(经济型): L-100K,L-90KLE-80K(老型号,1989年推出)Optima-MAX(台式) Nmax= 130,000rpm, RCFmax=1,019,000xgOptima-L-XP 系列 L-100XP,L-80XP
(日)Hitachi Koki CP-100WXNmax=10 rpm, RCFmax>800,000xg ,CP-90WX,CP-80WX(有与计算机联用的模拟软件, 在转头上自动记录离心数据,转头寿命自动管理),CP70MX70,000rpm CS150GXLCS120GXL,Nmax=15 rpm (小型机,目前世界上转速最高,离心力最大RCFmax=1050,000xg
(美国)Sorvall Ultra WX100,90,80(主机由日本Htiachi生产) Nmax=10 rpm, RCFmax>800,000xg

·高速离心机
(日)Hitachi Koki CR-GII 系列(2221
(美)ThermoSorvall RC-6Plus(主机由日本Htiachi生产)
(美)Beckman-Coulter Avanti-J 系列
(法)Jouan KR22iThermo集团)

·低速大容量离心机:
(德)Thermo-Heraeus Cryofuge 6000i
(日)Hitachi Koki CR-7 系列
(美)Thermo-Sorvall RC-3BPRC-12BPRC-3C plus
(美)Beckman-Coulter J6 系列
(美)Thermo-IEC PR-7000M(直流电机,有碳刷)
(法)Thermo-Jouan KR4i

·小型高速离心机

(德)Thermo-Heraeus Biofuge StratosPrimo/Primo RLEGEND T/RTMACH 1.6/1.6RLabofuge 200/300/400/400 RMULTIFUGE 4KR
(日)Hitachi Koki CF-RX 系列,CF-RXII 系列
(美)Beckman-Coulter Allegra 系列
(德)Sigma2K 系列、3K 4K6K系列
(德)Hettich Universal 系列、EBA 系列、Rotina 系列
(德)Hermle Z-233MK-2/MK-2Z323/323KZ383/Z383KZ513/513KZ36HKZ366160M300/300K等等
(美)ThermoSorvall T-21
(德)eppendorf 541554175804581058185824等等
(美)ThermoIEC Multi-RF (法)ThermoJouan MR 系列、BR 系列

实验离心机技术新进展:

设备:
近二十年离心机的转速、离心力加速度、容量、使用寿命,都有了很大提高,在驱动器、转头、电子、电器空控制、制冷系统、整机配置及附件等各方面都有了长足进步。至今,我们可以说,对于已知或未知的生物体组份,用实验离心设备进行分离纯化已经没有太多困难。现代离心设备除了直接按照使用者要求(转速、时间、温度、程序、转头等)进行离心实验外,还可以对各种样品的离心分离在离心前就离心条件进行探索和优化。 驱动部:有串激(或复激)直流有碳刷电机直接或间接(齿轮或皮带增减速)驱动演变为如今的变频电机直接驱动。

变频电机直接驱动的优点是:在各种不同转速都能输出最大扭距(这样就开发了如今的 很多种高-低速兼用型号,如一机多用提供了有效的驱动方式);维护和日常维修周期延长。原来的串激直流电机碳刷寿命一般在102~103 小时,碳刷的频繁更换及整流器的加工给用户 造成很多不便。使用变频电机后,驱动部的维护周期对高速离心机来说提高到3000~5000 小时以上(轴承更换)而对没有制冷设备的低速离心机和用油润滑的超速离心机,驱动部的 免维护周期可提高到十年以上;降低了运转噪声。免除了碳刷与整流器摩擦产生的高频噪声。实现了室内安静运转。(如HITACHI CS-150GX 超速机在150,000rpm 运转时噪声指标为 48dbA 以下);实现了对转速、加减速速率的数字化计算机控制,达到了很高的控制精度(如 100,000rpm 以下运转转速控制精度达到±10rpm);免除了碳粉污染,使得这类离心机可以进入无菌、无尘实验室,这对某些生物样品(如注射用药、疫苗、生物制品)及血液(血库、血站、血液中心)和医学研究的离心分离尤其重要;此外,同等功率的变频电机重量轻、体积小,便于装卸和修理;电机本身结构简单(和一般感应电机一样)成本较低。驱动部减震功能的改进使驱动部寿命增加,使肉眼观测液面水平而不用天平的常规离心操作 成为可能。

转头:

突出的改进表现在经计算机计算优化后的轻型转头;碳纤维材料制造的超速和大容量超轻转头;适用于生物大分子(DNARNA,蛋白等)离心分离用的小倾角转头(固定倾角 7°~10°);超高速,特大离心力转头等等。 
铝合金制造的轻型大容量转头:以往的6×500ml 角转头自重24kg 以上,经过计算 机的三元有限元法计算优化后。同容量,同转速(或更高)的转头重量只有14.5kg,大大减轻了操作者的负担。
 
碳纤维制造的超速及高速转头,重量轻,容量大。特别是在高速冷冻离心机中配置的 新型CF 角转头单管容量达到1000ml,总容量达到4~6l 
 小倾角超速固定角转头既保持了垂直管转头沉降距离小,纵剖面面积大分离时间短的 优点,也兼有一般固定角或转头作梯度分离时纯样品区带在减速过程中不接触沉淀的特点,最适用于质粒DNA,染色体DNARNA 分离。 
 超大离心力转头的开发:缩短了某些难以分离的生物样品的分离时间,减少了浓度扩 散的作用,提高了分离纯度和分辨率。微机控制;
PC 机联用的接口和软件;转头寿命的自动管理和转头寿命的自动延长;更多的故障自我诊断与显示;用户使用功能的增加;某些实用离心功能的设置(如高速离心机转头温度 的直接显示、在预置转速实际运转时间控制(RTC);显示屏上提供转头样本及模拟计算图形及数据;外接打印功能,联网遥控功能,高低速离心转头自动识别功能,非接触式不平衡保护、用户锁或密码设定功能、预冷功能、转头自动锁定功能等等);高亮度LCD 显示屏等等。 离心技术应用软件:
九十年代开始日立CP-α系列与Beckman XL 系列超速机开始设置模拟功能(沉降速度 法模拟与沉降平衡法模拟)本世纪初Hitachi Koki CP-MX 系列离心机又增加了供与PC 机联用的模拟软件。这样就扩展了模拟计算功能。利用模拟可以在离心前对某一特定样品选 择最佳离心参数;在离心后根据某些已知参数计算样品分子量、沉降系数、扩散系数、微分比容等等。这种机型还把转头历次运转的转速、时间数据全部记录在转头下部的磁环上,实现了真正意义上的转头寿命自动管理。

故障自我诊断与显示:是现代离心机完美服务的一个特色。九十年代初一般离心机只 提供少量的故障自我诊断,其中大部分是保护功能。而如今的超速离心机已经能提供近百种故障的自我诊断结果,为排除故障提供了依据。(对部分稍有技术条件的单位可自行维修) 用户使用功能的增加:如RCF 计算,ω 2t 自动计算与设置;在显示屏上提供各种实用菜单。提供使用说明书上的部分内容等等。 显示屏:九十年代前使用的LED 显示屏,CRT 显示屏及一般黑白LCD 显示屏已改 为目前的高亮度彩色背景液晶显示屏。清晰、柔和、分辨率高,令人赏心悦目,06年起日立开始配置彩色触幕屏。

制冷系统:

使用压缩机制冷的高速、大容量和台式机都已实现了无氟制冷,并在最高转速运转时样品温度可保持在4~5℃以下。九十年代起Beckman Hitachi 的超速离心机开始使用半导 体制冷元件代替压缩机制冷。体积小、噪声低、温控精度高是它的特点。而近年来又采用了第三代Peltier 效应电子热泵,使半导体制冷元件的寿命提高到10 年以上。

离心方法新进展:

·实验离心技术的数学计算:(包括沉降方程的建立,Svedberg 方程的建立,离心加速 度、沉降速度、沉降时间、沉降系数、分子量、扩散系数、微分比容、液体动压力转子K 系数Pi 系数等等)在70 年代以前已经建立;而离心方法(差分离心法、速率-区带密度梯 度离心法,等密度离心法以及分析超离心的沉降速度法、沉降平衡法-包括纹影光学系统、干涉光学系统,吸收扫描光学系统等等)则在更早些时候就已经得到充分的研究。其中一些 简单的运算已被广大实验人员熟练地运用。但涉及分子量、沉降系数、沉降速度、扩散系数等较为繁复的运算工作,只有极少数研究人员在用。微机在离心机上的应用以及PC 机的普 及从八十年代开始开发沉降平衡法及沉降速度法的计算机模拟,利用制备超速离心机和离心 技术的数学分析来探知生物样品的沉降过程。在已知某些参考条件下计算SMD 等重要 参数。尤其是前者,对某些样品的离心结果知之甚少的情况下,预先利用离心分离软件来优化选择离心参数有很高使用价值。值得注意的是某些离心机还专门为与PC 机联用开发了模 拟软件,既降低了离心主机的价格,又扩展了模拟计算范围,收到了很好的效果。

·某些特定样品离心方法的研究和推广。如:质粒DNA 分离:用小角度转头,CSCL E.B.Triton-x-100 的自形成梯度平衡等密度离心法(文献1213血清脂蛋白的离心分离:包括单次垂直管离心法等等((11),(14)) ; 超高速、小容量的生物大分子快速离心分离法(文献12)等等。

 参考文献:

1) SvedbergT. Pederson K.The UltracentrifugationOxfordUniversity press.(1940)
2) Pickels,E.G. J.Gen.Phys. 26, PP341~360 1943
3) Pickel,E.G.
Centrifugation inBiophysical Research Methods
Interscience,New York (1950)
4) Brakke,M.K. Adran.Virus.Res. Vol.7 193~224 (1960)
5) Kahler,M. J.Phys. Colloid Chem.55,1344-1350(1951)
6) Meselson,M
Proc.Nat.Acad.Sci. U.S. 43,581~588,(1957)
7) De Duve ,C.J. Cell Biol.Vol.50,No.1, 20~25(1959)
8) Anderson,N.G. Anal.Biochem. 31,255;32,460(1969)
9) Rechard, E.G. J.Phy.Chem. 63,1578(1959)
10) Nichols,J.B.
Physical Methods of Organic Chemistry
3rd ed. Pt.II, Interscience press.New York (1959)
11) B.H. Chung etc. J.Lip.Res. Vol:21 PP284~291 (1980)
12) D.Rickwood,B.D. Hames,
Preparative Centrifugation- A Practical Approach
OxfordUniversity Press (1922)
13)
余兴明 质粒DNA 的超速离心分离
生命的化学,1994.1
14) 余兴明 血清脂蛋白的离心分离技术 生命的化学,1997.3
15)余兴明 离心技术讲座(有21篇文章和大量的分离实例)2005-2006

 作者:余兴明   电话:13764301893,yuxingming@techcomp.cn

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