用高分辨率熔解数据的内部标准校正杂合子检测

摘要：

      背景：用于基因分型的高分辨率熔解曲线技术既简单又有效。在以熔解为基础的方法中，探针法是基因分型的黄金标准，可以将等位基因与目标的匹配完全区分开。小片段基因分型法是代替探针的基因分型法。异源双链核酸分子的存在使得检测纯合子变得容易，其熔解峰的形状有明显的改变。纯合子G/C或A/T的基因分型比较困难，因为其等位基因的Tm值相似。这些碱基对改变的纯合子用小片段法很难区分。样品间的温度、buffer和体积的变化限制纯合子的分离。不管仪器是多么精确，用户操作的变化是需要注意的，减少这种变化的方法可以改进小片段基因分型。利用内部特定反应的标准可以克服这些限制。
      方法：合成校准的核苷酸，与其互补链的浓度相同。用普通PCR仪进行PCR反应，反应时有LC Green和内标的存在。PCR反应之后，将其放入LightSanner中，扫描55℃-97℃范围内的数据。标准品熔解的特征是成一条线的，用于转换每个样品的荧光数据。测序之后确认基因型。我们通过测量每个样品的峰形与基因型一致的平均Tm值的距离，评估较正之前和之后纯合子基因分型的错误率。 当样品的Tm值与不正确分组平均Tm值相近时，可以观测到错误。
      结果：通过扫描大量的样品板及PCR目标校准，使得碱基对SNP突变的基因分型敏感性从90%增至99%。校准之后，Tm标准差从0.056降至0.027℃。
      结论：在小扩增子内用温度内标可以改进G/C和T/A的碱基改变的基因分型。此工作由美国国立卫生研究院的R44DK069106和R44HD053215到SFD和R42GM072419和R42GM073396到CTW资助。

背景：
      由于核苷酸的遗传性能，变性或熔解，基因型之间的特征是多样性的。以探针为基础的基因分型有相当大的特定等位基因温度偏移——几摄氏度的优势。高分辨率提供全部双链转换的详细的图，使排除探针法变得可能。另外，检测全部扩增时，可以获得每个实验碱基数目的密度达到20倍的。尽管如此，因为潜在的相似的熔解温度和熔解形状，探针系统检测纯合子是比较困难的。小片段法提供一种简单的基因分型解决方案。

方法：
       PCR反应体系为10ul，包括1×Lightsanner高敏感性基因分型的matermix（Idaho Technology），包括热启动酶，Mg2+，buffer及其它组分，核酸内标提供独立于PCR的大约在62℃和92℃的熔解曲线。引物包括0.10或0.15um， 人类基因组DNA10-15ng。 PCR反应条件如下：95℃变性2min， 1个循环；94℃ 30s， 63℃-67℃（取决于实验） 30s， 45个循环，结合了退火和延伸。最终的退火步骤是28℃,30s。用探针法分析所有的DNA样品进行基因分型。
      在LightScanner96(Idaho Technology)上进行扫描，收集数据，温度范围为：55℃-97℃。熔解数据通过平滑曲线尺校准之后接近荧光数据。其次，每一个内标存在的Tm值是通过样条数据代数的差值顶点来计算的，应用偏移和直线标尺因素排列每个校准。这个移动过程排列扩增子的熔解曲线，使最小化变小。数据用三次仿样函数曲线尺重新取样，用Lightsanner软件进行分析。分析扩增子Tm值周围的温度范围（用/不用提前校准好的内标），显示派生峰。

结果：
        图1显示的是校正之前的完整的熔解峰显示。 从低温和高温内标及扩增子熔解的中部区分熔解信号。

图1：派生熔解曲线显示校准和扩增子的熔解峰。左边和右边的峰是校准内标的峰。94的熔解剖面图，接近76℃，从独立的PCR反应中生成。校准分子没有对其，纯合子的扩增峰没有清楚的分开。中部最窄且高的峰是CPS1A/T多态的A/A（蓝色）和T/T（红色）纯合子基因型。添加的颜色以以前探针基因分型为基础，并不是以小片段基因分型数据为基础。较宽的中间峰形成A/T杂合子。在这个插图，显示放大峰的顶端。

图2： 用内标改进的派生熔解峰。在板子上显示荧光信号，板子包括了94个独立的关于CPS1、OTC、MSH2和PAH变化的PCR反应。CPS1双峰杂合子在校准之前就很容易区分（图2a）。相反，OTC杂合子（图2c）只显示了一个明显的峰，在校准之前很难决定。分析内标数据可以容易的确定基因型，在复制反应中可以清楚的观察到不同的基因型。  

表1：从4块板中的1块复制板对比每个目的基因校准前和校准后的Tm值分离。就一切情况而论，校准后Tm值变低。可以从校准后低的标准差和非交叉范围看出。
表1： 每个扩增板包括同样集合的47个基因组DNA样本（94个独立的PCR反应）。以临近参数为基础，列出所有纯合子的预测的Tm值。杂合子的Tm值没有包括在内，因为他们是，一般而言，在我们系统中可以不用内标就可以基因分型。观察值的Tm值比理论值高于5-7℃。 在某种程度上，LC Green染料可以使DNA:DNA杂合更稳定。虽然，没有内标的基因型分类是比较粗糙的，未校准的和校准之后的平均Tm值明显不同（p<0.001，非参数，U检验法）。
      CPS1和OTC PCR产物，临近分析预测纯合T/T和A/A扩增子的Tm相同。但是，对于两个目的基因，两个纯合子组之间的平均Tms是不同的，即使没有经过校正。尽管如此，校正T/T和A/A纯合子之间的重叠之前，如图示Tm值的范围。校正之后，T/T和A/A纯合子之间无重叠，显示基因型分离。MSH2和PAH小片段产物，临近分析预测包括纯合子之一的扩增子之间Tm值有微小的不同。在校准之前分析两种变化显示粗糙的基因分型。校正之后，确定纯合子的类型。表2显示的是纯合基因型的错误称呼。

表2：经验数据显示校正敏感性的效果。敏感性本质的改进可以在校正数据中显示。错误称呼以相近的Tm值为基础，不是文章中解释的Lightsanner软件称呼。图示每个小的目的片段扩增子生成的误称预测。
*没有指定OTC T/A的rs数目。

软件自动称呼
      随后的工作考虑到Lightsanner商业软件之内运算法则发展，自动分配样品到相似形状的组，这种以形状为基础的基因分型不需要已知Tm值。在一个喜欢的方式以Tm值为基础证实基因型之前，这种以形状为基础的称呼得益于校正。图3显示的是改进扫描CPS1小扩增子产物的板的结果。

图3：校准改善Lightsanner商业软件自动化软件称呼。每个屏幕截图在上部显示校正熔解曲线，在下部显示不同的平面图。此外，可以看到分组情况。屏幕截图左上部图中的红色、蓝色和灰色应该重复模仿1-6列与7-12列的对比。在这个资料组中，我们在校准之前获得敏感性是92%，校准之后的敏感性是100%。

校准减少Tm值反应体积的依赖
      预期Tm值依赖反应体积，因为96孔板的孔中更多的热质量，包含了更多的mastermix或矿物油阻挡热量转移。这对升高表面Tm值有影响。我们用OTC 小扩增子检测在mastermix体积之上的Tm依赖性，体积在7.0-12.5ul之间以0.5ul增量增加（仪器厂商推荐10ul），Tm值的依赖性在校正之前是牢固的（slope=+0.069,R2=0.798），但是校正之后就不一样了（slope=-0.001,R2=0.066）（如图4）。体积不同Tm值不同的效果用校准器有效的排除。

图4： 在校准之前和之后Mastermix体积变化对Tm值的影响。扩增47个样本，评估OTC基因c.299-8T>A变化。准备好的PCR反应液包括1ul模板DNA，体积变化的Mastermix，从7.5至12.5ul，每步增加0.5ul。 板A显示的是校正之前的熔解，有明显的变化。板B显示的校正之后的熔解，减少了变化。板C显示的是校正之前Tm值对Mastermix体积的的依赖性，扫描了反应的35个T/T纯合子样品。校正之后，可以观察到两件事情：1）压缩误差线，指示减少变化。2）斜率和R2值明显减少，显示Tm值与Mastermix之间的小的关系。与每个反应体积相对应的样品分布在板的一些地方，清除了依赖于板的位置的依赖性。

结论
      小片段熔解是一种简单的基因分型方法，不需要后续PCR操作。因为一些原因，小的扩增子适合基因分型。但是，没有校正也可以成功区分纯合子基因型，这不仅取决于采集的高分辨率熔解数据，也与样品之间的buffer、体积和抽提的一致性有关。校准器有效的去除了很多混杂变量。授给较好的，相对稳定的可以测量的、附随的更好的纯合子基因分型。