陆丽芳，Christain Kaisermayer, 姚钰舜，隋礼丽

通用电气医疗集团生命科学部，Fast Trak研发中心，上海

 

 

    Vero 细胞能被广泛应用于疫苗的生产。Vero 细胞的培养技术能否成功放大对于该技术能否大规模应用于疫苗生产至关重要。作为贴壁细胞，我们的经验证明Vero 细胞能够成功地用微载体技术在 WAVE 反应器中生长。为了进一步寻求放大培养的可能性，我们在 WAVE 反应器中进行了细胞从微载体 Cytodex  1 上的球转球实验。一系列的实验都相当成功。Vero细胞首先在 10 L的培养袋中用Cytodex 1微载体培养到一定密度，生长在微载体上的细胞随后用胰蛋白酶消化，经消化后基本脱离微载体的细胞最终和旧的微载体根据一定的传代密度转移到新的微载体培养体系中并开始新一轮细胞培养。我们的结果显示，几次这样的转移传代前后，细胞的生长速度基本一致。Vero 细胞的微载体培养技术在 WAVE 反应器中放大完全可能。进一步的实验显示，在现有的工作条件下，Vero细胞在 Cytodex 上的培养以及球转球工艺可以达到 10 倍的放大倍率。这为基于细胞培养的疫苗大规模工业化生产新前景提供了可靠的支持。

 

前言

 

    Vero细胞最初起源于非洲绿猴肾，已知对多种病毒如 SV40、  SV-5、 麻疹病毒、虫媒病毒、呼吸道肠道病毒、风疹、猿腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒、牛痘病毒等等，都敏感。Vero 细胞因而被广泛应用于针对相应疾病的疫苗开发[1]。最近针对流感疫苗的开发就使用到了 Vero 细胞[2]。知名的制药企业百特公司（Baxter  Healthcare)成功利用 Cytodex3 型微载体进行 Vero 细胞流感疫苗的生产，使用 3 级不同的发酵罐进行微载体球转球扩增，最终至 6000L 反应器的培养规模。诺华公司也早已在其欧洲的细胞培养工厂中得到许可使用细胞疫苗生产技术。诺华公司最近与美国卫生与公共服务部（HHS)达成协议，后者赞助前者 4.86 亿美元在北卡罗来那建立哺乳动物细胞疫苗生产基地，计划 2012 年投入使用[3]。细胞疫苗技术，具有快速和可靠的特征，作为全球发展的大趋势，将有望逐步替代目前的鸡胚疫苗技术。

       

    作为贴壁细胞，Vero 细胞需要生长于一定的表面，在小规模状态下可以用 T 型培养瓶或滚瓶来进行培养。国内微载体细胞培养水平和国外差距较大，多数仍使用转瓶/细胞工厂直接接种到 30L 发酵罐中，采用多个 30L 发酵罐平行放大操作。转瓶培养属于劳动密集型操作，无法对 pH、溶氧等参数进行精密控制，同时具有较高的污染风险。多个小型发酵罐的平行放大无法避免每个反应器之间的差异，增加了生产过程的控制点，不利于产品质量的稳定性和整个生产工艺的验证，限制了产能。

 

    因此需要开发大规模微载体细胞培养技术以满足生物技术发展的需要，而微载体球转球放大工艺就是其中的关键点之一[4,5]，以便在更大的工业规模进行培养和生产。衡量这一技术是否成功,  一方面固然是转移是否成功，同样重要的另一方面则是转移后细胞是否能有同样的生长状态。

 

方法

    在10升的细胞培养袋中，Vero在微载体 Cytodex 1 (Cyt.1)上贴壁培养，微载体浓度是 3-6g/L,悬浮培养体积 1.5-3L。在接种前一天，细胞培养袋预先被放置到WAVETM 反应器上，充满 10%  CO2,并加入 70-90%培养体积所需的培养液以及微载体，并在 37°C 摇动过夜以便使温度和 pH 得到充分平衡。接种当天，用胰酶把细胞从细胞工厂中消化下来，重新悬浮于新鲜的培养基中并转移到预先平衡的细胞培养袋中，细胞接种密度控制在每毫升 3-5x105个细胞。培养条件是，摇速 11  rpm，角度 4 度，温度 37°C。pH 控制在 7.0-7.3 之间。根据葡萄糖的代谢情况适时通过用新鲜培养液替换培养袋内的培养液来补充营养。每天采样监测细胞生长速度和状态。

 

    细胞计数的方法是，用含柠檬酸的结晶紫染色液破碎细胞，释放并染色细胞核，通过在显微镜下计数细胞核来确定细胞的数量。微载体上的细胞形态则通过固定，苏木素染色和显微镜来观察并照相。细胞密度达到约每毫升2-3x106个时，进行球转球实验。每次球转球实验后，细胞在WAVETM 反应器内用上述同样的方法进行数天的培养，观察生长状况。

 

    在瓶子内进行球转球实验

    在 WAVETM 反应器内细胞密度达到需要的水平时，Vero 细胞微载体培养悬浮液即被转移到另外一个透明的瓶子中并移到生物安全柜中。后面的清洗和胰酶消化过程等均在生物安全柜内进行。在微载体沉降下来之后，去除上清。剩下的微载体被转移到 500 毫升无菌透明的瓶子内（这是根据 2 升培养体积所需的瓶子大小，不同的情况应有不同的需求）。尽量多地去除上清。加入 400 毫升 37°C 预热的含 0.02% EDTA 磷酸缓冲液  (PBS-EDTA), 适当混合，待微载体沉降后去除上清。以上同样的过程重复 3次以使微载体得到充分洗涤。

 

    长有细胞的微载体在用 PBS-EDTA 充分洗涤之后，即用含 0.02%  EDTA 的 0.25%胰酶消化。2 升的培养体积（6 克微载体），胰酶用量为 300 毫升。胰酶预先在37°C 预热，在与微载体混合之后置于 37°C 中并每隔 10 分钟进行一次充分的混合。25-30 分钟之后，根据所需要的接种密度和稀释倍数，取一部分细胞-微载体-胰酶混合悬浮液到一个干净的无菌转移瓶内，与新鲜培养基混合并接种到一个新的培养袋中开始新一轮的培养。在 WAVETM 培养袋内进行球转球实验

 

    在 WAVETM 反应器内细胞密度达到需要的水平时，球转球实验在 WAVETM 培养袋内进行。实验开始前，准备装有 5-10 升 PBS-EDTA 的液体转移瓶和溶积 5-10 升的废液瓶，灭菌。准备 1 升的液体转移瓶两个，灭菌，并在无菌条件下分别装入胰酶和新鲜培养基。将 PBS-EDTA，胰酶和新鲜培养基分别预热至 37°C。

 

    在无菌条件下（如无菌管道焊接机）将这几个瓶子与细胞培养袋接通。整个实验过程中细胞培养袋均被置于反应器上。反应器停止摇动并停止加热以防过热或不均匀加热。培养袋内长有 Vero 细胞的微载体会在数分钟内沉到底部。用泵把尽量多的上清液移至废液瓶。加入一定量的 PBS-EDTA，轻柔混匀后，再次沉降微载体并移去上清。如此重复三次，每次使用 PBS-EDTA 的量不超过一个培养体积。

 

    长有细胞的微载体在用 PBS-EDTA 充分洗涤之后，与 37°C 预热的含 0.02% EDTA 的 0.25%胰酶混合，在微载体密度为 3g/L 时，胰酶的用量为 15%培养体积。胰酶的用量可根据实际情况作调整。加入胰酶后的混合液每 10 分钟轻柔摇动混合一次。25-30 分钟后，细胞培养袋内的悬浮液被转移至一个空的无菌转移瓶内。用少量新鲜培养液淋洗培养袋一次并和前面的合并。根据所需要的接种密度和稀释倍数，接种新的细胞培养袋并开始新一轮培养。

 

 

    这里有三次球转球实验（B2B  #1, #2, #3)。其中一次球转球实验(B2B #1)在培养袋外的瓶子中进行，另两次(B2B  #2 和#3)在 WAVETM 培养袋内进行。第一次（B2B #1)和第三次(B2B  #3)实验的 Vero 细胞来自通过细胞工厂接种到培养袋中并生长起来的细胞，而第二次实验  (B2B  #2)的 Vero 则直接来自第一次球转球实验后接种并培养起来的细胞。这几次实验我们均是在细胞密度超过 2x106时进行球转球，并把

放大倍数控制在 5-6 倍。表 1 列举的是这三次转移的大致情形。在第一次转移之前，细胞首先从细胞工厂接种到 10 升的培养袋内并培养生长到所需要的细胞密度。经过球转球之后的细胞培养也是在 10升的培养袋内进行。

 

表1.各次球转球实验情况

    每次球转球前后的细胞生长情况都通过每天采样来监测。图 1 和图 2 显示的就是根据每次培养每天细胞密度的增长情况绘制的细胞生长曲线。我们把相关联的放在一起做比较。其中图 1 显示的是 B2B  #1、B2B  #2 之前和之后细胞生长曲线，而图 2 则显示的 B2B  #3 之前及之后的细胞生长情况。我们可以看到在各次球转球实验前后，细胞都保持着良好的生长活力。在球转球实验之后，因起始细胞密度相比初始种子培养的稍低，因此需要多一天时间达到相似的细胞密度。总体来说，细胞生长的速度基本相同。

图1.球转球实验B2B #1和 B2B #2前后细胞生长曲线

图2.球转球实验B2B #3前后细胞生长曲线

 

    图 3 和图 4 显示的是球转球前后 Vero 细胞在微载体上的生长情况，分别有接种前第一、第三和第五天细胞的形态。图 4 的上面三张小图显示了球转球实验 B2B #3 之前来自细胞工厂种子培养的细胞生长形态。这是典型的 Vero 细胞种子培养的生长情况。通常 90%以上的 Vero细胞会在接种 4 小时之内贴到微载体上并在 24 小时内进入对数生长期。从图 3 和图 4 中各次球转球实验之后 Vero 细胞在微载体上的生长情况，可以看到球转球实验之后细胞保持有良好的和种子细胞培养相似的生长形态。

图 3.球转球实验 B2B #1和B2B #2后 Vero细胞在微载体上的生长情况

图4.球转球实验B2B #3前后 Vero细胞在微载体上的生长情况

 

    我们通过两种方式尝试把球转球放大工艺的放大倍率提升到十倍。第一种是用 6 g/L 的微载体密度培养 Vero 细胞至 4x10⁶/毫升左右的细胞密度。球转球以后以十倍的放大倍数（培养体积放大，微载体表面积放大，或者两者兼具）开始新一轮的培养。第二种是如上以 3g/L 的微载体密度培养，待细胞密度接近 3x10⁶

时，进行球转球实验，并采用培养体积和微载体表面积均为十倍的放大倍率。为弥补起始细胞密度过低可能会带来的生长缓慢，我们尝试在球转球之后用较少的培养体积培养。待细胞数增长到一定程度时，再添补新的培养基到需要的体积。观察球转球前后的细胞生长情况。

 

    B2B  #4 采用第一种方式进行高倍率放大，即用 6g/L 的微载体密度培养 Vero细胞至细胞密度 4.3x10⁶/毫升,培养体积为 2 升。用胰酶把 Vero 细胞从微载体上消化下来。取十分之一的细胞/微载体悬浮液接种到新的 2 升的培养体积中，微载体浓度为 6g/L,这样培养体积及微载体表面积的放大倍数均是十倍。作为平行比较试验，取十分之一的细胞/微载体悬浮液接种到另一个 2 升的培养体积中，微载体浓度 3 g/L,如此培养体积放大十倍，微载体表面积放大五倍。两个培养同时进行，观察细胞生长的情况。

图5.球转球实验B2B #4前后细胞生长曲线

 

    图 5显示的是球转球实验B2B  #4前后细胞生长曲线。有意思的是球转球以后的两个平行培养中细胞增长速度基本相似，虽然其微载体密度相差了一倍。它们比种子培养多用了 1-2 天达到相似的细胞密度。这应该是球转球之后培养的起始细胞密度相对较低所致，但细胞倍增速度并不低。球转球之后两个培养前四天的细胞倍增速度均是 0.57 d-1，而种子培养前四天的细胞倍增速度是 0.54 d-1。

 

    图 6 显示的是球转球实验 B2B  #4 前后 Vero 细胞在微载体上的生长情况。可以看到球转球之后的培养虽然起始细胞数较少，但细胞贴壁和存活情况仍然不错。在其后的几天中细胞生长的形态也很稳定和良好。虽然在最初几天看似细胞在微载体上分布不均匀，但细胞增殖正常并在其后几天迅速布满所有的微载体。

图6.球转球实验B2B #4前后 Vero细胞在微载体上的生长情况

 

    B2B  #5 采用第二种方式进行高倍率放大。用 3g/L 的微载体密度培养 Vero 细胞至细胞密度 3.07x10⁶/毫升,培养体积为 3 升。用胰酶把 Vero 细胞从微载体上消化下来。取十分之一的细胞/微载体悬浮液接种到新的 1.5 升的培养体积中，微载体浓度为 6g/L。待细胞密度达到 5x10⁶/毫升以上时，补充新鲜培养基至培养体积 3升。这样培养体积及微载体表面积的放大倍数均是十倍，最终微载体浓度为3g/L。而在培养初期，细胞密度和微载体密度均得到提高，从而提高了微载体和细胞的接触机率，理论上有利于细胞贴附到微载体上并能更好地生长。作为平行比较试验，取十分之一的细胞/微载体悬浮液接种到另一个细胞培养袋中，培养体积 3升，微载体浓度 3g/L。两个培养同时进行，观察细胞生长的情况。

图 7.球转球实验 B2B #5前后细胞生长曲线

 

    图 7 显示的是上述球转球实验 B2B  #5 前后的细胞生长曲线。由于其中一个在培养过程中有培养体积的变化，这里的纵坐标采用细胞总数。球转球前后细胞生长速度基本一致。球转球以后细胞仍然保持旺盛的生长活力。同样有意思的是，球转球后采用较小的培养体积培养，从而使单位体积内细胞密度和微载体密度提高，细胞和微载体接触机率提高，这样的方法并没有显著地提高细胞的生长速率。这表明细胞在稍低的接种密度下也能很好的生长起来，并不需要用降低起始培养体积的方法来提高接种密度。

图8.球转球实验B2B #5前后 Vero细胞在微载体上的生长情况

 

    图 8 显示的是上述球转球实验 B2B  #5 前后 Vero 细胞在微载体上的生长情况。因球转球之后培养中细胞起始密度较低，培养时间延长了两天。也因此，除了相应于种子培养的在第一、三、六天的细胞形态外，我们这里也列出了球转球后培养了九天后细胞在微载体上的形态照片。球转球后细胞贴附和生长情况良好。我们也看到分别用 1.5  L 和 3  L 的起始密度培养细胞最初的贴附情况，贴附数量，以及后面的细胞生长情况基本没有差异。这也提示了提高单位体积内细胞密度和微载体密度，从而提高细胞和微载体接触机率的方法并没有带来太大的好处。

 

讨论

 

    在这一部分的工作中，我们做了 Vero 细胞从微载体上的球转球实验，细胞培养在 WAVETM 反应器内进行，球转球实验在瓶子内或 WAVETM 培养袋内进行。实验结果显示球转球实验相当成功，Vero 细胞的微载体培养在 WAVETM 反应器内放大是可行的。

 

    我们分别尝试了在瓶子中（B2B  #1）和在 WAVETM 培养袋中（B2B  #2 和 B2B #3)进行球转球实验。在实验室小规模情况下，在瓶子中进行球转球实验相比在细胞培养袋中进行有一定的优势。前者操作起来比较容易。在一个透明的瓶子中，沉降后的微载体更容易被清晰地看到，所以能更多地去除上清。这样微载体能得到更有效的清洗。另外瓶子也可以用水浴来保持恒温，如果不太大的话可以较剧烈地摇动。这样细胞能更有效地脱离微载体。然而，如果考虑到大规模的培养，球转球实验需要在 WAVETM 培养袋内进行，因为这样就有一个全封闭的系统来更好地操作较大的体积。从WAVETM 培养袋中进行球转球实验（B2B  #2和B2B  #3) 得到的结果来看，这种方法效果也很不错，只是需要较多的 PBS来洗涤，胰酶的用量也稍多。

 

    胰酶消化较长时间能够更好地使细胞和微载体完全分离。但消化太长时间也会降低细胞活力并影响细胞重新贴壁的效果。因此胰酶消化的时间最好能控制在40 分钟之内。消化过程中，除消化时间外，酶用量、反应温度、微载体和酶之间充分的混合是保证不同微载体上细胞同步消化的重要因素，从而有效避免酶的局部过量和潜在的细胞损伤。

 

    相比搅拌罐而言，WAVE 反应器在同一个培养袋中可以有更宽的培养范围（10-100%工作体积），对于种子扩增和细胞消化的不同反应体积，都可以提供均匀有效的混合，从而实现微载体的原位消化，而无需特定的消化反应器。避免了消化前后微载体的转移，操作简单，均匀有效的混合有利于精密控制消化反应的条件，最大程度保证细胞的完整性和回收，成为微载体球转球成功放大的关键。

 

    球转球实验 B2B  #4 和#5 的结果提示，球转球进行高倍率放大也完全可行，放大倍率可以达到十倍，前提应该是让种子培养达到足够的细胞密度以保证能有足够多的细胞进入下一步培养。足够的细胞接种密度，以及细胞数和微载体表面积的比例两者共同保证了细胞的有效贴壁并快速进入生长期。而我们的实验表明，球转球后微载体表面积或者是培养体积的在小范围内的变化均不会对细胞的贴壁和生长产生太大的影响。

 

    我们在这里所描述的几次球转球实验均是把一部分旧的微载体同细胞一起转移来完成的。从各次球转球实验前后细胞在微载体上生长的形态来看，细胞能在微载体上均匀地分布。因此，旧的微载体同细胞一起转移并不影响细胞贴壁到新的微载体上。如果不和旧的微载体一起转移的话，就需要把细胞和微载体分离。这就意

味着需要额外的步骤和较长的工艺时间。这些额外的步骤还需要更多复杂的设备因而也增大了污染的风险。由于细胞没有在微载体上不均匀的分布或更集中于旧微载体的情况，我们认为没有必要把细胞和旧的微载体分开。

 

结论

 

    通过在瓶子里或直接在细胞培养袋中进行的细胞和微载体分离的方法，WAVETM 反应器中的球转球实验能够成功地进行。且放大倍率可以很容易地达到十倍。转移之后 Vero 细胞能保持和种子细胞相似的生长特征。生长在微载体上的Vero 细胞用 37℃预热的 PBS-EDTA 洗涤，用 37℃预热的胰酶进行处理，胰酶处理的时间不超过40分钟。转移过程中没有必要把细胞和旧的微载体分开。

 

    WAVE 微载体球转球技术为微载体细胞培养的规模放大提供了可靠支持，该技术可以在同一个培养袋中实现原位消化，然后直接转移到更大规模的 WAVE 反应器中重新贴壁扩增而无须使用单独的消化反应器，消化条件容易控制，设备投资成本低；无菌焊接机和封口机配合细胞培养袋可以方便的实现无菌管道化封闭生产，不仅操作简单避免污染，同时防止操作人员对病毒的暴露，实现更加安全的生产操作。因此，WAVE 生物反应器进行规模化微载体细胞培养可以取代繁冗的转瓶和多个小规模反应器的培养工艺，成为疫苗规模化大生产的发展趋势。

 

参考文章

[1]. History and Characterization of the Vero Cell Line -- A Report prepared by CDR Rebecca  Sheets, Ph.D., USPHS CBER/OVRR/DVRPA/VVB for the Vaccines and Related Biological  Products Advisory Committee Meeting to be held on May 12, 2000 OPEN SESSION www.fda.gov pdf

[2]. Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain  induces cross-protective immune responses. Kistner O, Howard MK, Spruth M, Wodal W, Bruohl  P, Gerencer M, Crowe BA, Savidis-Dacho H, Livey I, Reiter M and others. 2007, Vaccine 25(32):6028-6036.

[3]. Flu Vaccine Race Against The Clock. Thayer AM. 2009, Chemical & Engineering News, September 28, 2009, 87(39), p27-33

[4]. A novel mammalian cell (Vero) derived influenza virus vaccine: Development, characterization and industrial scale production. Kistner O, Barrett PN, Mundt W, Reiter M,  Schober-Bendixen S, Eder G, Dorner F. 1999. Wiener Klinische Wochenschrift 111(5):207-214.

[5]. High immunogenic enterovirus 71 strain and its production using serum-free microcarrier Vero cell culture. Liu CC, Lian WC, Butler M, Wu SC. 2007. Vaccine 25(1):19-24.