一种快速有效的基因分型斑马鱼的方法

       为了促进斑马鱼的高通量的基因分型，我们开发了一种新的技术——用高通量熔解分析（HRMA）区分野生、杂合、纯合突变。这种耗时一个小时的技术不需要进行限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳的操作。此技术生成的熔解图的敏感性高，可以检测不明确的PCR产物。我们可以对斑马鱼的三种类型的突变进行可靠的基因分型，包括apchu745（apcmcr）和p53zy7 （p531166T ），小的缺失突变（bap28y75）及逆转录病毒的插入突变（wdr43hi821a）。这种技术可对单个斑马鱼胚胎及个体进行基因分型并适用于其它类型的生物体。Developmental Dynamics 238:3168-3174，2009©2009 Wiley-Liss，Inc。
关键词：熔解曲线   斑马鱼  基因分型  SNP  点突变  插入突变

简介
       斑马鱼作为有机体遗传模型正在成熟。考虑到比较容易维持大量的突变线，且大量的鱼位于每个突变线，大规模的基因分型需要有效的高通量的基因分型技术。突变的多种类型导致斑马鱼突变，增加了基因分型的复杂性。ENU诱变剂——诱导斑马鱼突变的主要物质，经常导致单个碱基的突变，小的缺失插入也会发生。第二种比较普遍的方式是插入诱变，用逆转录病毒插入或转座因子插入破坏基因。因此，有效的基因分型这些突变类型的方法是必须的。
       提供一种更快、有效、令人满意的基因分型方法，有100%的精确度。寻找高通量的技术/方法，去除掉比较浪费时间的步骤。随着扩增基因组DNA 的PCR技术的出现，典型的基因分型技术包括Southern印迹法和放射性方法（RFLP和SSCP）已经逐渐被淘汰。一些基于PCR的方法用于偶然产生或消除限制性内切点的突变。大多数方法，除了测序方法之外，需要用PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳。当数百个或成千上万个样品需要基因分型时，这项工作就变得浪费时间且费用较高。
       对于产生或消除一个特殊的限制性位点的突变而言，以PCR为基础的限制性片段长度多态性（RFLP）是一种有用的技术。在这个实验中，设计PCR引物扩增感兴趣的范围。PCR产物用合适的内切酶消化，用琼脂糖凝胶电泳检测消化产物。根据纯合突变、杂合突变和纯合野生型的限制形式进行基因分型。
       衍生的酶切扩增多态性序列（dsCAPS）与RFLP相似，限制的消化模式用于决定基因型。不同的是在PCR引物中引入多个错配，所以额外的错配，在PCR扩增产物中产生一个特殊的限制性位点。接着，用琼脂糖凝胶电泳检测消化的PCR产物，再根据相应的限制消化形式进行基因分型。但是这技术有自身的缺点，不完全消化导致的错误的基因分型（如：纯合突变误判为杂合突变）。另外，需要的限制性内切酶一般很少且很贵。
        等位基因特异性扩增（ASA）是另外一种基于PCR的方法。进行两次PCR反应，用2条不同的上游引物，其中一条对野生型等位基因特定的，另外一条是对突变特定的。在这种情况下，一条引物3’端的核苷酸与野生型的点突变相一致，另外一条引物3’端的核苷酸与突变的序列相一致。这种错配序列的扩增和退火细节取决于这种方法的特异性。这种方法的缺点是，由于PCR过程中的错误扩增，造成假阳性的情况比较复杂。
       逆转录病毒突变（或插入其他外源DNA序列比如说转座因子）根据逆转录病毒插入位点或野生型DNA的PCR扩增的特异性来进行基因分型。这些PCR反应可以单独进行，一个反应做野生型等位基因，另外一个做突变，也可以做多重PCR。在这种情况下，用的是同一个上游引物。两个不同的下游引物，一条退火成逆转录病毒DNA，另一条退火成野生型DNA。多重PCR反应中，设计PCR引物，使野生型等位基因和突变型产物大小不同，在琼脂糖凝胶电泳上可以检测出来。如果PCR反应成功，纯合突变在琼脂糖凝胶电泳上可见一条突变产物，杂合动物有两个产物，纯合野生型动物可见一个野生型产物。这种技术非常精确，但是因为长的PCR反应而比较浪费时间，另外需要琼脂糖或其他高分辨的凝胶剂检测。
        如果没有提供上述技术，DNA测序也是动物基因分型的一种选择。在这种情况下，在感兴趣范围的侧翼区设计引物，并扩增PCR。通过对PCR产物测序显示个体动物的基因型。这种分型方法避免了琼脂糖凝胶电泳的检测。然而，测序所用的时间及费用是这项技术的缺陷。
        高分辨率熔解曲线分析（HRMA）是分析PCR产物的齐次方法，不需要PCR反应之后的操作。其应用包括筛查突变、基因分型及序列匹配。主要应用于人类，最近报道了这些技术。
       我们开发了一种有效、精确基因分型斑马鱼的方法，可以检测多种类型的突变。我们用一种快速有效，不需要琼脂糖凝胶电泳检测的方法进行了两个碱基对的替换、一个缺失和一个逆转录病毒的插入的基因分型。这种方法用高分辨率熔解分析方法分离胚胎或个体鱼的纯合突变，杂合子及纯合野生型。

结果
       为了克服现有基因分型技术的缺陷，需要从以下3个方面改进：（1）去掉效率低且昂贵的限制性内切酶。（2）去掉对琼脂糖凝胶电泳或其他PCR之后操作步骤的需要，但是保持区别非特异性产物的能力。（3）增加目前基因分型的速度。高分辨率熔解曲线分析方法符合上述3个要求。
        HRMA用的是敏感性高的成像仪器（我们实验用的是Lightscanner），在一定温度范围内量化DNA双链。通过使用一种依赖DNA的荧光化学物质——LC Green染料来量化DNA双链，此染料与双链DNA紧密结合且发光。LC Green染料与其它燃料如Sybr-Green 相比，可以用于DNA的饱和浓度而不抑制PCR反应，能够产生高敏感性的熔解曲线。随着样品的加热，不断的检测荧光的发射。一旦达到特定DNA饱和双链的熔解温度，可以检测到荧光信号的剧烈下降。获得派生的熔解曲线，且在y轴描述每单位（-dF/dT）荧光信号随着横坐标x轴温度的增加的的阴性改变。小的变化，甚至是单核苷酸多态性，在DNA双链的熔解温度上发生改变。在此，我们应用HRMA方法对两个缺失突变，一个小的缺失和一个病毒插入突变进行分型。
        这种技术不需要限制性内切酶，琼脂糖凝胶电泳，且因为PCR产物小于60bp，整个PCR反应及熔解分析在1小时之内完成。另外，PCR产物的特异性可以由熔解曲线的一致性决定，比如说，如果在PCR反应中有污染，会显示额外的熔解峰。提供Lightscanner软件可在10分钟内自动分析数据。

单核苷酸多态性（SNP）检测
       ENU是正向遗传学通用的诱变剂，ENU引起的最普通的突变是单个碱基对的改变，引起单核苷酸多态性，区分野生型和突变等位基因。我们区分了斑马鱼线的一个p53突变——p53zy7，此突变经由ENU诱变F3正向遗传学筛查。此突变是T→C转化在基因的DNA结合范围生成I166T。因为p53zy7/zy7突变纯合突变线是完全可见的且没有形态学的不同，因此分子基因分型斑马鱼个体是必要的。首先，对包括突变的范围进行测序是区分基因型唯一可靠的方法。为发展一种高通量的鉴定突变的方法，HRMA开发了针对这些位点进行基因分型的技术。我们用Lightscannrt引物设计软件设计包括突变位点（Fig.1A）的引物。整个的PCR产物是39个碱基对。一般而言，PCR产物越小，Tm值的差异越大。但是，在点突变或小的缺失的情况下，Tm值的差异受序列改变的较大限制，而不是引物设计。野生型和突变DNA双链的单个碱基对的不同造成野生型和突变等位基因之间的Tm值相差近1.5℃。为了检测以上所述的情况，我们从杂合交叉的鱼个体中准备了48个尾部修饰的DNA样品。根据这些样品的PCR产物生成的熔解曲线，我们观察到纯合野生和纯合突变的斑马鱼的熔解曲线的形状不同（Fig.1B）。明显的，我们的protocol参数允许评价杂合度。PCR程序结束时，加热样品至95℃使DNA变性，之后快速冷却形成异源双链核酸分子。因此，除了有中间的Tm（野生型和突变同源双链之间是～80℃），杂合子有较低的Tm产物，这是因为异源双链的不稳定性。
用另一个错译的等位基因验证这项技术，同时检测这项技术是否可以有效的用于晶胚的基因分型，我们从侧翼设计引物有一个T—C的错配突变在apchu745（apcmcr）（Hurlstone et al., 2003)。PCR产物是53bp，预计纯合野生型和突变之间有Tm值有1.5℃的差异（表1C）。从杂合晶胚中得到48个DNA样品。再次进行溶解曲线分析，结果产生了三种不同的溶解曲线（表1D）。在这种情况下，该突变等位基因有胞嘧啶核苷酸，因此，有较高的Tm值，因此，杂合样品产生了一个中间的同源双链峰和一个异源双链峰。
 
 
Fig.1. 应用HRMA对p53zy7（p53I166T）和apchu745（apcmcr）进行点突变基因分型。A：p53I166T 错译突变周围的序列。有下划线的为引物序列，星号标注的是SNP位点。野生型产物的Tm值为79.5℃，突变型为80.9℃。B：Melting curves of the PCR products from 48 tail-clip genomic DNA samples isolated from the adult progeny from a cross of p53zy7/þ heterozygotes. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.C：apchu745错译突变周围的DNA序列，下划线标注的是引物序列，星型标注的是SNP位点。野生型产物的Tm值是80.9℃，突变的为82.0℃。D：Melting curves of the PCR products from 48 embryonic DNA samples generated by crossing a apchu745/t fish to apchu745/t fish. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue
curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.

      p53基因型（12野生型：24杂合子：12突变型）和APC基因型（11野生型：25杂合子：12突变型）符合孟德尔的1:2:1的比率。此外，通过对p53的24个样品以及APC的24个样品进行测序，也验证了HRMA的结果的准确性是100%。

缺失检测
    除了SNP的检测，我们还想评估是否HRMA可以提供斑马鱼小缺失的基因分型。斑马鱼突变体的bap28的第2外显子有5个碱基对的缺失（Azuma et al.,2006）。在缺失的侧翼设计引物，结果产生46bp的野生型产物和41bp的突变产物，二者的Tm值有1.6℃的差异（表2A）。分析48个DNA样品，每一个代表一个杂合—杂合的胚胎，产生了三种不同的溶解曲线（表2B）。在这个分析中，较少的纯合突变产物的Tm值较低，杂合子表现出中间的Tm值产物和异源双链的产物。和p53以及APC的基因分型相似，BAP28的基因型（12野生型：25杂合子：11纯合突变）的比符合孟德尔的1:2:1的遗传比率，而且24个不同的基因型都通过测序进行了验证。

Fig.2. 通过溶解曲线进行bap28突变小的缺失的基因分型。A：bap28缺失突变周围的DNA序列。下划线标注的是引物序列，虚线标注的是缺失。野生型产物的Tm值是76.8℃，突变型为75.2℃。B：从bap28y75/+杂合子得到的48个晶胚的PCR产物的溶解曲线。聚类后，红色曲线表示野生型样本，蓝色曲线表示突变型样本，黑色为杂合样本。

转录病毒插入检测
       斑马鱼的插入诱变是一种常见的也是一种有效的研究基因打断的方法（Golling et al., 2002; Balciunas and Ekker,2005）。我们想设计一种方法验证HRMA是否可以用于斑马鱼的特异性插入的基因分型。该突变系hi821a（Amsterdam et al., 2004）在wdr43基因的第二内含子有一个逆转录病毒的插入（表3A）。设计引物产生一个小的产物，用Tm值来区分野生型和突变的等位基因（表3B）。分析插入突变的引物设计比点突变的引物设计更加灵活；目的是设计的PCR产物有更大的Tm的差异。理想情况下，临近插入位点的引物都可以用于PCR产物，尽量减小两个产物的同源序列。对于hi821a等位基因，正向引物（插入位点在基因内区2,50）包括突变和野生型等位基因。引物只针对野生型和插入突变设计，因此，产物有不同的大小和不同的溶解温度。对于hi821a位点，野生型等位基因内含子2的反向引物，在插入位点30，插入突变的反向引物接近逆转录病毒LTR的50末端（表3A）。因此，纯合野生型或突变都只有一个产物和一个Tm值（表3C）。虽然引物A和B或A和C2在理论上都能扩增得到突变等位基因的产物，大片段的产物（7+ KB）随着延伸时间的缩短（4sec），选择性的扩增各产物。此外，在这种情况下，较大的产物可能被扩增，这一产物的Tm值可能会高并且易于在分析中排除。在杂合子中多有的产物都被扩增。这些产物有截然不同的溶解温度，三种不同的基因型很容易检测到（表3C）。值得注意的是，在分析插入突变时一个重要的步骤是PCR反应的最后一步没有加热到95℃，而且加了一步72℃的延伸以确保只形成同源双链。Wdr43的基因分型（12野生型：24杂合子：12突变型）遵循孟德尔定律。所有24个基因型都通过PCR引物扩增野生型等位基因（583bp）和突变等位基因（230bp），然后进行琼脂糖凝胶电泳检测来验证。
 
Fig.3. 通过高分辨溶解曲线进行逆转录病毒插入突变wdr43hi821a进行基因分型。A：wdr43hi821a的基因组。B：野生型和突变等位基因的DNA序列。下划线标注的是引物序列。野生型的Tm值为73.0℃，突变型的Tm值为81.1℃。C：从wdr43hi821a/+得到的48个晶胚的DNA样品的PCR产物的溶解曲线。聚类后蓝色的为野生型样本，红色曲线为突变样本，黑色为杂合样本。

讨论
      通过高分辨溶解曲线（HRMA）很容易就区分出了斑马鱼中三种不同类型的突变。与其他方法相比该技术有许多优点。所用的时间和PCR所必备的程序明显少于其他方法。PCR可以快速进行，而且溶解曲线的分析要快于进行琼脂糖凝胶电泳。无需使用稀有的和昂贵的限制性内切酶。PCR的有效性和特异性高，可以去除进行下游分析的不确定性，例如进行酶切就容易出错。
尽管我们在斑马鱼中应用了该技术，HRMA还可以用于其他模式生物中。从任何生物中得到的DNA都可以进行HRMA。大多数小鼠的基因分型都要敲除等位基因，这里也可以用HRMA这种方法进行基因分型以及插入突变的分析。SNP/小缺失检测的方法可以用于检测不太频繁的小鼠missense or floxed的等位基因。类似于斑马鱼，线虫（C.eleagans）和(D.malanoganster)主要突变的点突变，小的缺失或插入。此外，本研究中描述的这种方法需要从任何生物中提取DNA。因为高分辨溶解曲线分析的灵敏度可以允许检测单核苷酸的差异，因此通过扫描整个基因可以找到突变的位置。大的人类基因例如BRCA1（van der Stoep et al., 2009）和CFTR（Montgomery et al., 2007）通过扫描的方法比测序要更有效。人类（Liew et al., 2004）和植物（McKinney et al., 2009）的基因分型以及微生物物种分析都可以应用。
       TILLING这项技术曾应用于斑马鱼中经过ENU诱变的特定基因的突变鉴定（Till et al., 2003）。这一技术涉及到使用稀有的，异源双链分子特异性酶Cell1的酶切，来检测不配对的DNA，随后还要进行凝胶切割和成像。这种方法不仅繁琐而且需要昂贵的设备。类似于人类突变的扫描，其他基因也可以使用HRMA技术扫描得到可靠的结果而且要比TILLING花费少且节省时间。
       该技术的一个限制就是要使用LightScanner。不过也可以在灵敏度较低的一起上进行HRMA，例如Roche LightcycleVR480或Qiagen Rotor-Gene Q，只要PCR产物可以容纳总够的Tm值差异。此前发表的数据显示不同的仪器可以不同灵敏度下检测PCR产物的溶解差异(Herrmann et al., 2006, 2007a,b; Reed et al., 2007)。HRMA的应用范围将继续增加（Vossen et al., 2009）。该技术已经成为我们实验室进行动物模型基因分型最有效的方法，并且在突变扫描方面也是非常有价值的技术。

实验方法

DNA提取
晶胚或Tail-clip放置于96孔板中，去除晶胚中的水，然后在每个孔中加入100µL的ELB（10mM TRIS pH8.3, 50mM KCl, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40, 1 mg/mL  Prot K）,55℃培养4hr 至过夜，这根据样品的大小决定。板95℃加热15min已钝化蛋白酶K。

PCR和溶解曲线分析
引物设计，HRMA可以依据不同纯合扩增子Tm值得差异来区分不同的基因型（Liew et al., 2004）。这种差异可以使用任何一种软件包的邻近参数来估算Tm值。除此之外，引物设计没有特定的要求，使用任何引物设计软件都可以。点突变的引物设计可以使用Lightscanner引物设计软件（Idaho Technology）。然而对于小的缺失或插入，可以手动设计引物，然后使用Vector NTI程序来预测产物的Tm值（Invitrogen）。PCR可以在MJ Research 96孔PCR仪上进行。所有的反应使用96孔板（BioRad HSP9665）。SNP检测和小的缺失的PCR反应程序是：95℃ 15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃ 2sec（40 cycles）。之后95℃ 10sec,4℃冷却，4℃保存。逆转录病毒插入检测的PCR反应程序是：95℃ 15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃ 4sec（35cycles），随后72℃ 30sec，4℃冷却，4℃保存。PCR试剂：1×ExTAQ PCR buffer，1× dNTPs（250 µM each），1× LC Green Plus，0.5µM 引物，1µL 基因组DNA，0.25U ExTAQ，10µL反应体系。PCR结束后在LightScanner上65-95℃进行溶解曲线分析（Idaho Technology）。升温速率为0.1℃/sec。使用LightScanner软件进行溶解曲线的归一化后进行分析（Wittwer et al., 2003）。基因分型全部由软件自动化完成（Palais and Wittwer, 2009）。96孔板的溶解大概需要10min，基因分型不到5min。

PCR引物
• P53 FWD (F3): GCGCCTGCTGGTCA
• P53 REV (F4): CTGATTGCCCTCCACTCTT
• APC FWD (F29): CCACTAATAATGTTGCAGCTGA
• APC REV (F30): GACTGATGATTGGCTCTCAGA
• BAP28 FWD (K73): AAAGAGGTCAACAAGAAACTG
• BAP28 REV (K74): TGAGGAAGAGAGAAATGCTC
• WDR43 FWD (K51): ACAAGATTCTTAAGGGATAAAGT
• WDR43 REV (K56): GTAAATCATCATTAACATCTATTACC
• VIRUS REV (K53): GAGTGATTGACTACCCGTCAG
• WDR43 FWD (SG9): CCATCCTCATCTACAGCACACTGA
• WDR43 REV (SG112): GGGTTAATGGGACCAACTGA
• VIRUS REV (SG22): GTTCCTTGGGAGGGTCTCCTC