Rob Darrington，Genevac Ltd.，英国伊普斯威奇市

 

干燥高效液相色谱（HPLC）纯化馏分（主要成分为水和乙腈）是众多实验室中一项常见且重要的实验任务。实验的要求是将样品干燥成粉末状，以便准确称量样品、进行二次取样或再次溶解。因此，冷冻干燥是实验的首选技术，但是常规的大型冷冻干燥系统可能难以处理有机溶剂，因为有机溶剂很容易在样品中暴沸，并因此损坏真空泵，造成样品损失。Actelion Pharmaceuticals采用Genevac公司¹ 开发的快速冻干法（LyoSpeed™），使用Genevac HT-12离心蒸发仪来完成这项工作。LyoSpeed方法通过离心机来控制样品的沸腾情况，使有机溶剂浓缩，并避免样品损失，然后从冷凝器中抽出有机溶剂，使剩余的水份冻干。这种方法对于亲水性样品而言非常有效，但如果样品不能溶于水，已经去除有机溶剂的样品将会溃散，甚至会形成油脂状。这些样品则需要更进一步的处理才能形成所需的干粉状态。

 

标准化合物库的平均操作成功率（完全冻干vs油性化合物）约为50％。根据化合物的不同属性，最低和最高操作成功率可分别达到30％和90％。取得较高操作成功率的简单方法，就是让样品冻干并使乙腈仍然保留在样品中。遗憾的是，现有的设备还无法实现这样的操作效果。

 

在硬件上也存在一定的限制因素，尤其是HT-12蒸发仪中溶剂冷凝器（VC3000）表现出的温度特性。VC3000可以达到的最低温度为-50°C，这就限制了蒸发系统可以达到的真空度。为了取得良好的冻干效果，真空度应尽可能低，最理想的状态是能够达到0.1mbar以下。例如，0.5mbar压力条件下纯净水的沸点为-32℃，但乙腈在同等真空条件下的沸点可降至-61°C，因此会在煮沸时喷出冷阱和堵塞真空泵，导致蒸发系统中的压力上升。压力上升会提高溶剂的沸点，致使冻干效果不理想，甚至会导致冻干过程彻底失败。使用LyoSpeed方法的目的不在于使样品彻底冻干（如生产疫苗），而是要制出非油状干燥粉末。正如真正的冻干过程一样，只有实现更好的真空度，才能获得更好的实验结果。

 

 

问题的解决办法很明确，即实验室需要更能制冷的冷凝器，以便在低真空度条件下使样品浓缩并保留住乙腈成分。 研究人员与Genevac公司的工程设计团队合作，通过连接至HT-12蒸发器的VirTis Benchtop K -85°C冷冻干燥机 (BTK)，对 VC3000 冷凝器进行了一系列的基准测试。工作团队根据相应的实验结果，开发出了命名为VC6000（图1）的HT-12新型冷凝器。 VC6000的设计根据BTK的构造演变而来，具有更强的冷凝功效、可缩短除霜时间，且具有Genevac系统耐溶剂性。

 

图 1 – 连接VC6000冷凝器的Genevac HT-12蒸发系统

进行测试的Genevac HT-12蒸发系统与VC3000，BTK或VC6000冷凝器相连。10ml样品成分为水和乙腈混合物（体积比为50:50），制备样品的容器为直径16mm高度100mm的玻璃瓶，管壁厚度为1.2mm。坚实的PVDF塑料样品架放置于HT-12蒸发器的翼侧，并装有24支玻璃试管。每支玻璃试管中的溶剂成分为： 非化合物，或20mg Diovan或市售的20mg其他化学物质，以及亲脂性材料邻苯二甲-β-丙氨酸（AI028492）。Diovan和AI028482都是较难从HPLC馏分中冻干的样品，因此这样的组合形成了“最难处理”的样品。在两种负载情况下测试每一款冷凝器。一种情况采用4架样品（96支试管），另一种情况采用12架样品（满载288支试管）。

 

所有样品和每一款冷凝器都采用相同的方法：

1.    利用Dri-Pure®真空坡道控制样品沸腾/暴沸情况，操作时长为 1小时

2.    无热全真空处理，操作时长为3小时

3.    在40°C温度条件下对样品架进行全真空热处理，操作时长为4小时

4.    全真空无热处理，操作时长为18小时

第4阶段的处理时间很长，采用这种方法进行测试，实际的干燥时间可由记录的数据图表获取。

 

冻干之后，需要对每一试管中的化合物状态进行评估，确定其是否已成功冻干为散干粉，或已经形成含有少量油质的样品，或是每一试管中是否仍有残余溶剂。 干燥时间可被视为温度汇聚到样品架和样品上的时间。

图 2– 每一测试条件下的冻干结果

Test System：测试系统

Number of Tubes: 试管数量

Compound: 化合物

Drying Time （Minutes）：干燥时间（分钟）

Count of Condition of Sample after Drying : 干燥后的样品状态

Light Oily:少量油脂

 

如果冻干之后没有发现残余样品，则达到100％的测试成功率。因此，放置于BTK的96份样品中仍有2份样品没有干燥的实验结果出人意料。由于此结果并未在较高样品负载量的实验条件下重复出现，因此没有作出进一步调查，并将其视为异常实验结果。

 

VC3000冷凝器处理实际样品时的操作成功率最低。Benchtop K的操作性能更好，但因其内部容积过小而无法同时对288支试管进行冻干处理。VC6000冷凝器的操作性能最佳，这与预期的结果相一致。以下两点值得注意：

1.    为什么附带Diovan的VC6000冷凝器在样品低负载量和高负载量两种情况下表现出不同的操作性能？ 样品低负载量情况下所需的干燥时间也更长，这与预计的结果截然不同。

2.    在每一项试验中，处于每一位置的样品成分完全相同，并且均取自同一储备溶液，但为什么每支试管之间的干燥性却如此不同？

 

查看实验数据图时（如图3a和3b所示），可明确地找出使用VC6000进行两项样品（含Diovan成分）实验得出不同结果的原因。图3a显示出较轻的样品负载量，黄线表示样品温度，这不会与表示样品架温度的粉色线相交叉。这表明样品仍然潮湿，如同实验结果所示。 

图 3a – VC6000冷凝器上带有Diovan较轻样品负载量（96个样品）的数据图

 

造成此实验结果的原因无法立刻得知，从而需要作出进一步调查。其约1.5mbar的真空度不足使样品冻结和完全干燥。导致问题的根本原因在于涡旋真空泵（Scroll pump）的性能略有下降。对于处理有机溶剂蒸汽的系统而言，涡旋泵（Scroll pump）无疑是最佳选择，而且不会产生损坏真空泵的油脂。正如所有真空泵操作一样，为了确保最佳的操作性能和取得最好的实验结果，必须对泵进行定期维护。对于涡旋泵的日常维护，需要每隔3个月就检查一下端部密封件，以确保性能良好、易于操作并且减少污染。

图 3b – 带Diovan的VC6000冷凝器上较高样品负载量（288个样品）数据图

 

如果需要研究处理相同样品的三种不同冷凝器的压力曲线，只要在较高负载量中使用纯溶剂，如图4所示，功率更大更制冷的冷凝器（VC6000）能够将压力保持在较低水平，这表明冷凝器具有极强的冷凝溶剂 功能。实现成功的冷冻干燥，最重要在于保持所需的低压条件，而决定这一条件的至关重要的两个元素即好的真空度和功能强大并充分制冷的冷凝器。

 

图 4 – 高负载量条件下3处冷阱的压力性能数据图

工作人员在每一项测试中都谨慎地使用洁净的全新玻璃器皿、溶剂和样品，因此可排除污染的可能性。对实验结果的另一种解释是，由于化合物本身在样品表面形成了覆膜，因此可能阻碍或完全阻塞蒸发过程。冷冻干燥系统的使用者细致地描述了“滤饼阻力（cake resistance）”的概念，覆膜的厚度也可能随着样品深度的加大而增加。干燥化合物库的实际研究结果显示，样品表面形成的覆膜会对干燥造成阻碍，以致会残留几毫升液体。样品研究工作人员报告称，具有特定化学性质的部分化合物库在表面容易形成覆膜。对于使用AI02492（图5）进行的实验操作，少数样品无法干燥的原因至今不明。虽然形成覆膜可能是导致此结果的一个原因，但这无法解释为什么只有14份样品无法干燥，而另外274份样品则完全干燥。

 

图 5 –高负载量试验条件下使用AI02492 （连接VC6000）冻干后潮湿试管的位置

说明 – 黄色 = <0.5ml  红色= <4.5ml  白色 = 干粉

 

 

 

实验结果表明，相比测试所用的其他系统，VC6000具有更卓越的冷冻干燥性能（尤其是在高负载量情况下）。系统的真空度是取得良好实验结果的关键因素，这需要一个密闭的真空系统和功能强大并且充分制冷的冷凝器。VC6000冷凝器已被用于执行日常工作流程，在对于溶解方式高度变化（一些是在90%有机溶剂中洗脱，一些是在90%水中洗脱）的多种化合物构建的“真实化合物库”来说，也会出现类似的蒸发实验结果。甚至现在一些样品是放置在铝制样品架进行处理，得到的实验结果仍然是一样的。

 

作者衷心感谢瑞士阿尔施维尔Actelion Pharmaceuticals公司化工部的高级实验室研究人员Viktor Ribic，感谢他长久以来所做的研究工作，以及为本文提供宝贵的实验数据。

 

1.  Developments in Laboratory Scale Lyophilisation for Purification Laboratories.  

Induka Abeysena 博士，Rob Darrington, 2006,可通过www.Genevac.com查阅

 

适合HPLC馏分的一项先进的冻干技术 (128次)    An improved lyophilization technique for HPLC fractions (41次)