Wnt 非经典途径对小鼠阿尔茨海默病模型的作用及机制的初步探讨

【摘要】 目的 探讨 Wnt 非经典途径对小鼠阿尔茨海默病模型的作用以及机制。方法 选取 90 只 4 个月龄的SD 雄性小鼠，随机均分为正常对照组、假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组 15 只。正常对照组不予处理，假手术组注入一定量的生理盐水，模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠用基底核注射海人藻酸建立阿尔茨海默病模型，造模成功后连续给药氯化锂，经过小鼠跳台实验测定被动回避次数; 处死小鼠后，测定脑组织中白细胞介素 1β( IL － 1β) 、白细胞介素 6( IL － 6) 、肿瘤坏死因子( TNF － α) 的浓度变化。结果 模型组、低剂量组的被动回避次数与假手术组比较明显升高( P ＜ 0． 05) ，高、中剂量组小鼠与模型组比较被动回避次数均明显降低( P ＜ 0． 05) ; 与模型组比较，低、中和高剂量组细胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 明显下降( P ＜ 0． 05) ，且中、高剂量组下降更显著( P ＜0． 05) 。结论 高、中剂量组剂量的氯化锂能显著改善小鼠的学习记忆成绩，且疗效均优于低剂量氯化锂。氯化锂 Wnt非经典途径对小鼠阿尔茨海默病模型起积极的作用，有助于改善阿尔茨海默病。

【关键词】 小鼠 阿尔茨海默病 Wnt 非经典途径 氯化锂 机制

Wnt 是分泌性蛋白，Wnt 的受体为 Frizzled 或低密度脂蛋白相关蛋白( LＲP) ，两者相结合时，就可以激活下游的信号通路。这些信号通路是一系列的，主要可以分为经典通路和非经典通路两组，非经典的通路包括PCP 通路和 Wnt / Ca2 +的通路。Frizzled 受体包括 Friz-zled － 5、Frizzled － 1 等等，Wnt配体包括 Wnt8b 、Wnt7a、Wnt7b、Wnt5a 、Wnt3a、Wnt2b 等等，这些不同的配体会激活相应的不同受体。Wnt 非经典通路的配体或受体基本上是 Wnt5a 或 Friz － zled － 5，当 Wnt5a 配体与其Friz － zled － 5 受体结合后就会激活下游的通路。当通路被激活以后，所形成的 Wnt － Frizzled 复合物接下来就会激活蛋白 dishevelle( DVL) 。对于 Wnt 的经典通路来说是控制细胞命运的通路，激活的 DVL 会使糖原合成酶激酶 3β 受到抑制，即 p － 糖原合成酶激酶 3β 增加，最终导致 β － catenin 的稳定性增强。β － catenin 有较强的稳定性以后，会通过转导，进入到细胞核中，细胞核中有核转录因子 TCF/LEF 家族，β － catenin 就会与核转录因子 TCF/LEF 家族结合，这种通路来调节目的基因的转录。Wnt 非经典通路有两种，在控制组织极性和细胞运动的 PCP 通路中，被激活的 DVL 会使 Ｒho A、JNK 、NLK 三种信号级联; 在与心脏发育原肠胚形成期调节细胞的运动有关的 Wnt/Ca2 +通路中，Wnt 配体与Frizzled 受体结合后，激活 PKC 和 Ca MKII。研究 Wnt信号通路较多的是与癌症和肿瘤有关的，Wnt 信号通路也与神经精神类疾病息息相关，Wnt 在神经系统中主要的作用是促进海马神经的发生、树突发育、轴突导向以及神经递质的释放等。本研究就对 Wnt 非经典途径对小鼠阿尔茨海默病模型的作用以及机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1． 1 材料及造模 本研究选取 90 只 4 个月龄的 SD 雄性小鼠，体质量为 24 ～ 28 g，均购自湖南省实验动物研究中心。购来后用鼠笼喂养，适应性喂养1 周，让其自由摄食与饮水。随机均分为正常对照组、假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组 15 只。接下来建立阿尔茨海默病的模型小鼠，模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠先用 1% 戊巴比妥钠( 20mg / kg) 进行麻醉，用脑立体定位仪（上海欣软公司提供）上将其固定，把颅骨线处的皮肤剪开确定 Meynert 基底核( nb M) 的位置，然后在颅骨上钻直径约 1． 0 mm 的小孔，在 nb M 的两侧用微量注射器注入 1 μl 的海人藻酸，为了破坏该区域的胆碱能细胞，要慢慢地注入海人藻酸，最好停针 5min。术后及时进行术后处理，不仅要缝合皮肤，而且为了避免感染要按时给予小鼠青霉素，连续 3 d。15 只正常小鼠作为正常对照组不予处理，假手术组仅按照同法注入等量的生理盐水。

1． 2 方法

1． 2． 1 实验方法 用蒸馏水制备氯化锂溶液，并制备氯化锂的高浓度溶液( 20 mg /ml) 、中浓度溶液( 15 mg /ml) 、低浓度溶液( 10 mg / ml) 。成功后第 2

天除正常对照组、假手术组、模型组灌服等容量的蒸馏水外，其它各组均按上述剂量灌服相应药物，均按照每天 5 ml/kg 体积给药，每天 1 次，连续 15 d，整个实验过程小鼠每隔 3d 称重 1 次，并依次调整给药剂量。在灌胃给药过程中，各组均有 3 只小鼠死亡，最终进行实验的小鼠每组有 12 只。

1． 2． 2 小鼠学习记忆检测 通过小鼠跳台实验法（上海欣软公司提供），设计考察氯化锂对模型小鼠学习记忆的影响。跳台实验是一种一次性刺激回避反应的实验。术后第 10天进行小鼠跳台实验，先将小鼠放在电栅上，当电栅通电时就会有电击，小鼠受到电击就会跳上平台，通过跳台软件控制，小鼠再次跳下平台后又会受到电击，然后又会跳回平台，并记录每只鼠受到电击的次数，小鼠受到电击跳上平台称之为被动回避反应。1 d 后再次测验时，先将小鼠放在跳台上，记录第一次跳下的时间( 即为潜伏期) ，小鼠被动回避反应，作为学习记忆成绩，连续检测 5 d。观察小鼠的记忆保持情况。

1． 2． 3 小鼠海马组织 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 的测定术后第 2 天给药处死小鼠，断头，取脑组织 0． 2 ～ 1． 0g，在生理盐水中漂洗，除去血渍，用生理盐水制成 10%匀浆液。将匀浆液以 3 000 rpm 离心 5 min 后，取出上清液，冷冻。严格按照放射免疫试剂盒( 购自北京福瑞润康生物技术有限) 说明步骤操作，测定计算海马每毫克组织中 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 的含量。

1． 3 统计学方法 所得数据采用 SPSS 13． 0 软件进行统计学处理并作比较分析。数据以均数 ± 标准差( x珋± s ) 表示，计量资料采用 t 检验，计数资料采用 χ2检验。P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

3 讨论

阿尔茨海默病( AD) 是一种神经系统退行性疾病，多见于 70 岁以上的老人，且女性较男性多，65 岁以前发病者称为早老性痴呆，65 岁以上发病者称为老年性痴呆。主要表现为记忆力障碍、失语、视空间技能损害、执行功能障碍等特征，目前还没有明确的病因，可能的因素和假说多达 30 余种。家族史是该病的危险因素之一，某些 AD 患者的家属患同样疾病者比率高于一般人群，还可能有先天愚型患病的危险，可见痴呆与遗传有关。一些甲状腺疾病、免疫系统疾病等躯体疾病，曾被作为该病的危险因素研究。伴有意识障碍的头部外伤也被作为该病危险因素，而且有较多报道。此外研究猜测，免疫系统的进行性衰竭等，以及独居、生活颠簸等社会心理因素也可能成为发病的诱因。由于发病因素涉及很多方面，绝不能单纯地用药物治疗。根据认知能力和身体机能的恶化程度可以分为轻度痴呆、中度痴呆、重度痴呆三个时期。第一个时期一般表现为记忆减退、判断能力下降、工作漫不经心、情感淡漠、常有多疑等症状; 第二时期一般表现为远近记忆严重受损、简单结构的视空间能力下降、不能独立进行室外活动、出现各种神经症状、常走动不停等症状; 第三个时期患者已经完全依赖照护者，日常生活不能自理。对患者进行检查时主要是运用神经心理学测验、血液学检查、神经影像学检查、脑电图( EEG) 、脑脊液检测、基因检测等方法。目前临床上对阿尔茨海默病治疗的目的是控制伴发的精神病理症状，主要会出现焦虑、抑郁、精神病等精神病理症状，选择相应的药物可以对其进行治疗。此外还要用到益智药或改善认知功能的药，延缓疾病进展。作用于神经递质的药物可以加强中枢胆碱能活动，改善老年人的学习、记忆能力。脑代谢赋活药物可以扩张脑血管，增加脑皮质细胞对氧、氨基酸等的利用，改善脑细胞的功能，提高记忆力。大量研究已经证实阿尔茨海默病发生的病理过程与 Wnt 信号通路的功能异常存在密切的关系。目前主要是通过干细胞的移植并激活其内在的 Wnt 信号通路来促进新生海马神经元的产生，以弥补海马神经元的丢失来治疗阿尔茨海默病。细胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 在中枢神经系统中起到重要的作用，有助于机体的生长发育和内环境的稳定，在病理状态下，这些细胞因子异常表达，发生炎症反应，损伤组织细胞，氯化锂( Li Cl) 在发挥药物作用时主要通过 Wnt 非经典等信号途径，对一些异常细胞因子的表达和活性具有明显的抑制作用，对神经细胞、心肌细胞具有保护作用，改善患者的记忆和判断能力。Li Cl 作为高度选择性的抑制剂，在科研工作中用于 Wnt 非经典信号途径的激动，在心肌细胞分化等过程中起到了重要作用，通过抑制细胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 的活性来改善心肌细胞。

本研究采用基底核注射海人藻酸建立阿尔兹海默症模型，导致 nb M 胆碱能大神经元溃变，从而损害从nb M 到新皮层的胆碱投射系统，大脑皮层和海马胆碱乙酰转移酶活性和乙酰胆碱酯酶活性降低，最终导致明显的学习和记忆功能改变。在记忆研究中，一个最重要的动物模型就是抑制模仿活动或学习习惯。被动回避实验通过动物学会去掉某种特定的行为而逃避某种讨厌的事情。小鼠跳台实验操作简便易行，一次可同时观察多只动物，能较客观地反映动物经过一次刺激后记忆获得的情况，可分析益智药物的作用机制。本实验结果表明，正常对照组与假手术组在行为学方面无明显差异( P ＞ 0． 05) ; 但是与假手术组比较，模型组、低剂量组的被动回避次数在训练的 5 d 内均明显升高( P ＜ 0． 05) ，而高剂量组、中剂量组无明显差异( P ＞ 0． 05) 。与模型组比较，高剂量组、中剂量组小鼠被动回避次数在训练的 5 d 内均明显降低( P ＜0 ． 01 ) ，低剂量组自训练的第 15 天开始被动回避次数也明显降低( P ＜ 0． 05) 。结果表明，高剂量组、中剂量组能显著改善小鼠的学习记忆成绩，且疗效均优于低剂量组。经药物干预后，细胞因子 IL － 1β、IL － 6、TNF － α 明显下降(

P ＜ 0 ． 05 ) ，中剂量组、高剂量组下降更显著( P ＜ 0． 05) 。

4 结论

总之，高、中剂量氯化锂能显著改善小鼠的学习记忆成绩，且疗效均优于低剂量氯化锂，氯化锂 Wnt 非经典途径对小鼠阿尔茨海默病模型起积极的作用，有助于改善阿尔茨海默病。