1、什么是瞬时表达和稳定表达？

课前热身，了解的同学请直接进入题2

瞬时表达：外源片段不能随细胞分裂而一同复制，导致表达时间短暂，且表达量随时间逐渐下降。

稳定表达：是指外源片段整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去，表达量长时间处于稳定水平。

那稳定株，顾名思义当然是属于稳定表达的体系了。

2、我的实验是否需要筛选稳定株？

能够达到稳定表达的方法不止稳定株一种哦。我们使用慢病毒感染细胞，也一样可以达到稳定表达的效果。什么原理呢？

*慢病毒是整合型的逆转录病毒载体，感染细胞后，携带的外源片段会直接整合入细胞的基因组DNA中，并能够随细胞分裂稳定传代。所以对于大多数实验，包括细胞周期、凋亡、增殖等功能学实验，甚至裸鼠成瘤等长时间的实验，只要细胞感染效率较高（70%～80%以上），感染一次慢病毒就可以达到长时间、高效的基因操作的目的，满足实验要求，无须筛选稳定细胞株。

3、细胞感染效率较高（70%～80%以上），臣妾做不到啊，难感染的细胞怎么办？

少年，恭喜你选择了hard模式。那就赶紧召唤稳定株吧。那么问题来了，选择何种方式将外源片段整合入细胞基因组中呢？

质粒（常规转染/电转）：这种方法介导的整合几率和中500w彩票差不多哦😱(<<10^-6)，且整合进入的片段大小是随机的，常常不是丢了西瓜（目的基因）就是少了芝麻（抗性基因），导致假阳/阴性率高。

慢病毒：携带的外源片段在病毒重组酶的作用下直接整合入细胞的基因组DNA中，因此效率与质粒相比要高多个数量级。而且整合片段是固定的，目的基因和抗性基因终于可以手牵手一起走啦。

下面帮大家整理了利用抗性基因进行筛选的标准流程。

*药筛法关键在于药物作用浓度和时间的确定，这点根据细胞的不同需要经过预实验，还要保证在筛选出稳定株的同时药物不会对细胞的状态产生不良影响。

➢常用抗性筛选标志物：新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选。

筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）

💣此处有坑请注意：大部分细胞株是群居“动物”，需要同类的陪伴才能正常生长哦，若是不幸落单，则生长缓慢或者索性不长，再努力也拿不到单克隆株呢。

4、那么问题来了，同样是稳定株，单克隆？混合克隆？傻傻分不清楚～要怎么选？

单克隆稳定株：来源于含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增。

混合稳定株：由多个单克隆稳定株混合构成的克隆群，不同的单克隆其外源片段的整合位点不一样。

由于不同细胞基因组背景存在差异，且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞表型可能不一致，所以使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰，否则需要对多个单克隆稳定株进行比较，才能获得更精确的实验数据。

为了去除细胞间差异，得到更精确的实验结果，我们推荐您使用慢病毒感染，或者构建混合克隆稳定株！

● 感染效率70%～80%以上即可直接实验，不会受到质疑

● 高分低分文献都使用混合克隆，国际承认

● 筛选单克隆株至少要用两株细胞来去除细胞间差异，工作量翻倍，不划算

比如下面这篇5分文章，花了2个月构建稳定株，再吭哧吭哧把细胞功能学、动物实验都做了两遍。不但要保证两个单克隆株目的基因表达量一致，功能实验结果也要类似哦！要是不一致怎么办？换一株再重复呀，真是给自己挖了一大坑！

5、稳定株构建不出来，怎么办？可诱导表达的稳定株：TET-on慢病毒系统

下面两种情况，常规的稳定株构建式比较困难的，但是办法总比困难多

1）过表达：看基因功能。如果是抑制肿瘤细胞的增殖或促进肿瘤细胞的凋亡，那么是很难构建稳定株的（目的基因感染细胞后就会凋亡或不长）。

2）干扰：建议构建可诱导表达的稳定株。RNA 干扰敲减的是细胞内源在用的基因，敲减后，短时间内会看到抑制效果，但时间长了后，细胞内会有调控机制将被抑制的基因上调表达，甚至超过常规的量。

这两种情况下，建议病毒感染细胞后直接做功能实验或进行裸鼠成瘤实验。如果要做稳定株需要用TET-on慢病毒系统。

那什么是TET-on系统？具体如何使用呢？

我们下期见！