单细胞分析技术显著提升了对生物系统的理解,揭示了组织结构、病理变化和治疗响应中的细胞异质性,弥补了传统转录组中因信号平均化而掩盖复杂性的不足。单细胞RNA分析包括测序和成像两种方法,前者可全面捕获基因表达谱,但需解离组织,导致细胞环境破坏及空间信息丢失;后者通过荧光标记实现亚细胞级定位,可保留空间信息,但多重检测能力有限,难以覆盖全转录组。近年来,空间转录组学技术结合了空间信息与高通量能力,虽弥补部分不足,但在基因定位和单细胞边界划分方面仍存挑战
为此,CosMx Whole Transcriptome(WTx)技术孕育而生,可在CosMx空间分子成像仪(SMI)上以单分子分辨率检测18,936种人类编码基因,实现了转录组深度与空间信息的结合,并显著提升了多重检测能力。这项技术在多种复杂样本中验证有效,包括难以处理的FFPE组织。CosMx WTx为在完整组织环境中研究细胞行为提供了高通量、分辨率和性价比,开辟了生物发现与治疗干预的新途径。
01 CosMx WTx检测在人体FFPE组织样本中的性能表现
为评估CosMx WTx检测在人体FFPE组织样本中的性能,研究分析了结肠、胰腺、皮肤、肾脏、乳腺、大脑6种不同组织类型的5 µm FFPE切片,平均面积为99.99 ± 13.84 mm²,生成了每个组织中平均450,109 ± 154,610个带空间信息的单细胞。
通过核、细胞体和细胞膜的标记物进行细胞分割,如胰腺细胞的平均大小为71.99 µm²,而海马区细胞为167.76 µm²,符合组织特定细胞大小的常规认知。6种组织中检测到的基因数在8,392到15,960之间,其中6,647个基因在所有组织中均被检测到,而每种组织中有106到843个基因为特异性表达。每个细胞中检测到的转录本中位数为1,556(各组织范围为965-2,248),基因的中位数为905(范围为627-1,252)。总体而言,WTx能够在各种人体FFPE组织中以单细胞分辨率捕获1 cm x 1 cm区域内的基因表达。
单细胞区域的全转录组数据
02 空间全转录组技术与单细胞RNA测序的对比测试
为比较CosMx WTx检测与scRNA-seq的性能,研究分析了同一FFPE结直肠癌组织块的相邻切片。Flex scRNA-seq处理两卷25 μm厚切片后,最终生成6,257个细胞的数据集,而CosMx WTx用一张5 μm切片成功分割了493,929个细胞,解析细胞总数显著高于前者。CosMx WTx检测的转录本数量和基因分布更加均匀,优于scRNA-seq因潜在的多细胞捕获导致的分析混淆及检测效率。此外,CosMx WTx准确反映了组织细胞组成,而scRNA-seq因解离过程中难以处理密集或不规则细胞,导致某些细胞类型缺失。总体而言,CosMx WTx在单细胞解析和细胞组成保真度上具有显著优势。
CosMx WTx与单细胞RNA测序在FFPE结肠癌组织中的性能比较
03 CosMx WTx在培养细胞中的应用
为在培养细胞中应用CosMx WTx全转录组检测,研究采用了一种优化的样本制备方案,省略了热诱导回收步骤,并用温和的GluC蛋白酶替代了非选择性的蛋白酶K降解。研究发现,CosMx WTx在培养细胞中的表现优于FFPE组织,检测到的转录本数量明显更多,这可能与RNA质量较高、细胞内交联较少及高对比度的形态染色有关。例如,在HEK293T、SH-SY5Y和U2OS细胞系中,每个细胞分别检测到5,849、1,866和7,294个转录本。CosMx WTx还能够精准地进行细胞聚类和类型划分,每个细胞系在UMAP空间中呈现出明显的差异,并且通过特异性的转录组特征对每个细胞系进行准确注释。CosMx WTx显著提高了单细胞转录本定位的数据密度。为处理数百万个细胞和数十亿个转录本,CosMx SMI将数据实时传输至基于云的AtoMx空间信息平台(SIP),该平台能自动扩展CPU、GPU和内存,以处理大规模数据集。
CosMx WTx在培养细胞中的性能
04 CosMx WTx检测在结直肠癌中的应用
为了展示CosMx WTx检测的细胞分辨率、灵敏度和空间分析能力,研究分析了结肠腺癌FFPE切片的493,834个细胞。通过对414,005个通过质量控制的细胞进行细胞类型分析,利用PROGENy数据库和LIANA+ Python包,研究发现肿瘤巢内存在EGFR、TGF-beta和VEGF通路的富集。同时,TNF相关的TRAIL通路减弱,表明肿瘤表现出侵袭性特征。此外,肿瘤边缘的MAPK通路富集也进一步表明肿瘤的侵袭性。在肿瘤内部,通过局部配体-受体分析发现细胞粘附、迁移和增殖方面存在空间限制差异。整体来看,肿瘤的不同区域表现出不同的通讯模式和微环境特征。
结肠癌肿瘤内的空间异质性
总结与展望
CosMx WTx全转录组检测是空间转录组学领域的重要里程碑,通过原位成像方式即可实现全面的全转录组覆盖和单细胞分辨率。这项研究展示了可扩展的无酶杂交条形码技术,结合宽视场光学、低容量微流控技术、抗体标记的细胞形态识别以及自适应计算算法,提供了超高单细胞灵敏度和单细胞空间精度,具有潜在的变革性价值,为生物医学研究和诊断提供了新工具。
以下是CosMx WTx的主要特性和应用:
1) 高分辨率、高通量数据输出
2) 自适应解码算法提升数据质量
3) FFPE样品中细胞和转录本检出率显著提高
4) 广泛适用于各种组织类型
5) 转录本检测具有高动态范围
6) 完整覆盖空间解析途径及配体-受体分析
7) 基于云的数据存储、处理与共享
CosMx WTx测定重新定义了单细胞和空间转录组学的边界,解决了现有技术的局限,真正意义上实现了全基因组的单细胞空间研究需求,预计 2025 年可投入使用。未来,它有可能扩展至多组学分析,结合蛋白质及其他生物分子标记,以更全面地揭示细胞状态和组织结构。这一平台不仅将提升当前的研究水平,还将推动新发现和转化应用,设立单细胞和空间分析的新标准。