关键词
Q Exactive Plus，Q Exactive HF，TMT，Proteome Discoverer 2.1，蛋白质鉴定，相对定量，同量异序标签，多重定量

研究目标
在 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 仪器平台上，采用 Thermo ScientificTM TMTsixplexTM 和 TMT10plexTM 工作流程，建立最优的质谱数据采集方法将其应用于蛋白质的相对定量研究中。本文详细介绍了该工作流程所涉及的样品前处理、肽段分离和质谱分析等过程，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 软件 2.1 版本对数据进行处理和分析的具体流程。

背景介绍
同量异序标签（如 Tandem Mass 标签TM （TMTTM）1 或 isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification（iTRAQ®）2）是基于质谱技术的蛋白质相对定量方法中非常常见的一种。3-6 其中，基于 TMT 标签的多重相对定量方法具有很多优势，包括整个实验周期更短、波动更小，样品通量更高，以及样品间定量数据的缺失更少等。标记氨基的 TMT10plex 与 TMTsixplex 反应试剂的化学结构相同但是前者在质量报告区域中可以提供更多的 13C 和 15N 同位素组合形式。对于某些组合间彼此仅相差一个中子的质量，需要高分辨率的分析仪器实现串联质谱谱图采集才能进行区分。

Thermo ScientificTM TribridTM 质谱仪家族，包括 OrbitrapTM FusionTM MS 和 Orbitrap Fusion LumosTM MS 仪器，所提供的同步母离子选择（SPS）MS3 方法能够在具有高动态范围的复杂样品中实现最为准确的 TMT 定量分析。7，8 而 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 质谱仪系列仪器，结合了四极杆对母离子选择的高选择性和高特异性与 Orbitrap 质量分析器的高分辨率和准确质量（HRAM）检测能力的优势，也是进行同量异序定量分析的一把好手。Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus 质谱仪通过配备改进的四极杆技术（AQT）以优化离子选择能力和传输效果，同时提高了在窄小的隔离窗口内对低丰度离子进行定量分析的能力。9 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF 质谱仪引入了超高场 Orbitrap 质量分析器，能够以两倍于 Q Exactive Plus MS 的扫描速度实现高分辨率检测，表现出了更为优异的性能。9

基于 Q Exactive 质谱仪的 TMT 标记定量分析流程，不仅能够实现肽段和蛋白质鉴定结果的最大化，而且能够同时为多达十个不同样品提供高定量准确度的相对定量结果。该流程的前提是需要良好的色谱分离效果、充分分辨的质谱峰、足够的离子丰度，以及能以高扫描速度采集高质量的 MS2 碎裂谱图。本应用文档为 TMT 标记及其相对定量策略提供了详细的分步指导，包含样品前处理、仪器设置，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 2.1 软件对多重定量数据进行处理和分析。本文详细讨论了关键仪器参数（分辨能力、最大注入时间、自动增益目标值、碰撞能量和隔离窗口等）对蛋白质和肽段鉴定以及定量结果的影响，以保证用户能够参照本文成功地在 Q Exactive 系列质谱仪上建立 TMT 定量工作流程。

实验方法

TMT 标记
采用 Thermo Scientific TMT 试剂对 E. coli 酶解产物标准样品（Waters® Corp，Milford，MA）按如下步骤进行标记：
1. 将三乙胺碳酸盐 （TEAB） 缓冲液、TMT 标签和干粉状态下的样品从 -20 ℃ 转移至室温下平衡。
2. 将 500 μL 溶解缓冲液 （Dissolution Buffer，1 M TEAB） 加入到 4.5 mL 超纯水中，制备 100 mM TEAB 溶液。
3. 将单个样品（不超过 100 μg/TMT 标签） 溶于 100 mM TEAB 缓冲液，得到 1 μg/uL 的样品溶液，充分涡旋振荡，放置 10 分钟。
4. 在每个 TMT 试剂瓶中加入 41 μL 新鲜 LC-MS 级乙腈，充分涡旋振荡，放置 10 分钟。
5. 在每个 TMT 试剂瓶中加入不高于 100 μL 第 3 步中制备的样品溶液，涡旋振荡，孵育 1 小时。
6. 反应 1 小时后，向每个小瓶中加入 8 μL 5% 羟胺（将试剂盒中提供的 50% 羟胺储备液用水稀释 10 倍）以终止反应，孵育 15 分钟。
7.标记结束后，立即按所需比例混合不同样品。在本研究中，TMTsixplex 试剂（通道 126-131）的混合比例为 20:10:1:1:10:20。所选六种 TMT10plex 试剂（通道 127C，128N，128C，129N，129C，130N）以相同比例混合。
8. 将制备好的样品分成小份，干燥，在 -80 ℃ 下储存。
9. 进行 LC-MS 分析前将制备好的 TMT-标记样品重悬于 0.1% TFA/5% ACN （v:v）溶剂中；重悬好的 TMT-标记样品能够在 4 ℃ 稳定保存一周，避免反复冻融。
为考察定量分析的准确度，将 Thermo ScientificTM PierceTM HeLa 蛋白酶解产物标准样品（P/N 88328）按上述流程进行标记，将 TMTsixplex 通道 129–131 和 TMT10plex 通道 127N、127C 和 128N 分别以 10:10:10 比例混合，然后加入 E. coli 样品中，每通道比例为 1:1（33 μg HeLa 酶解产物 + 67 μg E. coli 酶解产物）。

液相色谱
色谱分离条件设置详见表 1。进样量相当于 1 μg 起始蛋白质。

质谱仪
通过液相色谱洗脱得到的肽段分别由 Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF 质谱仪在数据依赖采集模式下进行分析。仪器参数设置参见表 2。

 

表 3. 未标记样品的 LC 梯度。

时间	时长	流速	%B
0	N/A	300	2
5	5	300	2
105	100	300	20
125	20	300	32
126	1	300	95
134	8	300	95

 

表 4. TMT 标记样品的 LC 梯度。

 

时间	时长	流速	%B
0	N/A	300	5
3	3	300	5
5	2	300	7
105	100	300	25
125	20	300	60
126	1	300	95
134	8	300	95

 

随着样品复杂度增加，洗脱梯度也应相应地加长（e.g.，4 小时）以保证更好的色谱分离。然而加长洗脱梯度又不可避免地会导致色谱峰变宽以及母离子 S/N 降低。因此应当考虑增加进样量或是提高最大注入时间的限制。最终用于评价实验效果的指标应当是可定量肽段的数量，而所谓可定量肽段是指碎片谱图包含所有预测报告离子峰的那些肽段。如图 14 A 中所示，对于 1 μg 进样量，将洗脱梯度的时间从 2 小时增加到 4 小时，鉴定出的肽段数量从 3,241 个增加到了 3,810 个。鉴定结果显然受益于分离效果的改善，因为对低丰度肽段的检测灵敏度增加使得蛋白序列覆盖率也相应地提高了。另一方面，可定量肽段数并没有增加，因为最大注入时间设置与 2 小时的梯度相同（表 2）。如果在加长洗脱梯度的同时将进样量增加到 2 μg，则增加了 400 多条可定量肽段，将肽段的可定量数/可鉴定数所占比例提高到了 85%。同样地，可定量蛋白质组数也随着色谱梯度时间和进样量的共同增加而增加（图 14B）。这一结果说明，对于高动态范围的样品（20:1），实现色谱分离条件、进样量和最大注入时间的最佳匹配才能取得可靠的定量分析结果。

 

MS1 参数

TMT 标记对于母离子来说是真正的同量异序标签，因此 MS1分辨能力的设置是与未标记样品完全相同的: 对于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 来说，其分辨率分别为 70,000 和 120,000。这样的设置足以在不显著影响数据依赖扫描模式循环时间的前提下，分辨绝大部分共洗脱物质。 推荐 AGC 目标为 3e6，有利于提高全扫的动态范围。

 

MS2 分辨能力

MS2 分辨能力不够会导致背景或杂质离子信号与报告离子信号混为一谈，影响对 S/N 的评估。对于 TMTsixplex 标记的样品来说，分辨率设置为 30,000 能够保证报告离子与相近报告离子的同位素峰实现基线分离。12

对于 TMT10plex 试剂来说，13C 和 15N 同位素异构体的质量差异仅为 6 mDa。图 15 中显示的是不同比例下经 4 通道 （128N，128C，129N，129C）标记的肽段的报告离子区域。30,000 的分辨率设置不足以区分 N 和 C 同位素异构体。对于 TMT10plex 标记的样品，合适的 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS分辨率设置分别应为 35,000 和 60,000。

 

 

图 14. 分析 TMTsixplex 标记的 E. coli 和 Hela 混合样品时，增加进样量和梯度洗脱时间后可鉴定和可定量的 E. coli 源肽段和蛋白质的数量。

 

 

图 15. 分辨率设置分别为 30,000，35,000 和 60,000 时，TMT10plex 标记肽段报告离子区域细节图。请注意，在 30,000 分辨率下仅得到部分分离。

 

MS2 最大注入时间

MS2 最大注入时间需要根据进样量、样品复杂程度和洗脱梯度进行调整。通常来说，更长的注入时间能够积累更多的母离子，报告离子的强度会相应增加，更有利于中低丰度肽段的鉴定和定量分析。如图 16 所示，最大注入时间从 64 ms 增加到 100 ms 大大提高了可定量蛋白质和肽段的数量，也相应地实现了更高的定量分析率。

如前所述，更长的洗脱梯度需要更长的注入时间。另一方面，注入时间的增加不应该显著影响仪器的整体速度，尤其是在分析复杂样品的时候。一个理想的方法是将可允许的最大注入时间设成与 FT 转换检测时间匹配，因为该时间是与仪器分辨率设置直接相关的。对于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 来说，128 ms 的 Orbitrap 分析器检测时间对应的分辨率分别是 35,000 和 60,000，因此使用 100 ms 的注入时间与检测时间非常匹配，能够保证离子注入与 Orbitrap 检测的高效并行。如图 17 所示，增加注入时间同样有利于提升定量检测的准确度。

 

 

图 16. 使用不同仪器设置时，纯 E. coli 样品中可鉴定和可定量肽段和蛋白质组的数量。*方法设置详情参见表 5。

 

表 5. 图 16 中比较的每个方法的详细参数。

	MS2 IT	MS2 AGC	MS2 NCE
Method 1	64 ms	5e4	30
Method 2	100 ms	5e4	30
Method 3	100 ms	1e5	30
Method 4	100 ms	1e5	32

 

图 17. TMT-标记的纯 E. coli 中的比值。预期比例用虚线表示。请注意对于 128/126 和 129/126 比例，方法 4 的定量分析准确度最高。

 

MS2 自动增益目标值（AGC）

自动增益目标值是需要设置的另一个关键参数，其大小决定了 C trap 能积累并进入 Orbitrap 分析器中进行检测的最大离子数。虽然 S/N 和鉴定效率会随着离子数增加而增加，但偏高的 AGC 目标值设置会造成离子聚集或其他与空间电荷相关的问题。13 图 16 和 17 中比较了当进样量为 1 μg 时，AGC 目标值设置成 5e4 和 1e5 的定量结果差异。当该参数设置为 1e5 时，能够在获得更多可定量肽段的基础上，达到更好的定量准度和精度，而并未引起离子聚集现象。

MS2 碰撞能量

 

NCE 是一个无量纲数值，大致相当于质量数为 500、电荷数为 1 的参比离子的碰撞能（单位 eV）。实际使用的能量是根据所选母离子的质量和电荷数实时自动计算的。常用的 NCE 设置（e.g.，NCE 27–28）能够为肽段鉴定生成足够的碎片离子，不过事实证明它还不够使 TMT 报告离子解离并实现准确定量。然而碰撞能过大又会导致肽段过度碎裂，降低鉴定效率。14 通过研究发现，将碰撞能量从 NCE 30 提高至 NCE 32 能显著提高可定量蛋白质数而不会给鉴定效率带来负面影响（图 16）。 此外，高碰撞能还提高了定量分析的准确度（图 17）。因此，我们建议对 TMT-标记的样品使用比未标记样品高 4-6 NCE 的碰撞能。

 

MS2 隔离窗口
Q Exactive 类型的仪器通常建议使用 2 Th 的隔离窗口，能够保证足够的离子传输和灵敏度。然而，扩大隔离窗口会使干扰离子与母离子一并被隔离出来，降低了报告离子的定量分析准确性。

此外，干扰离子的碎片还有可能污染 MS2 谱图并导致鉴定得分降低。Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 都配备了 AQT，使得其在非常窄的隔离窗口设置下也能实现有效离子传输。我们分别在 0.7 和 1.2 Th 的隔离窗口设置下对 E. coli 样品进行分析，其鉴定和定量结果非常接近（图 18）。

 

图 18. 不同隔离窗口设置下的可鉴定和可定量肽段组数。显示数据是 E. coli 样品进行两次平行分析的综合结果。

 

为了评估适用于复杂样品的隔离窗口，将纯 E.coli 样品（127C:128N:128C:129N:129C:130N 按 20:10:1:1:10:20 比例混合）与等量 HeLa 酶解样品 （通道 127N，127C 和 128N 按 1:1:1 比例混合） 混合作为背景。结果显示，受到 HeLa 酶解产物干扰影响的 E.coli 通道 127C 和 128N，其定量比值较理论值和其他无干扰的通道有明显偏差（图 19）。采用更窄的隔离窗口 （0.7 Th）可以减少共提取的干扰，定量精度略好于较宽窗口（1.2 Th）。对于高复杂度的样品，我们建议使用 Orbitrap Fusion MS 和 Orbitrap Fusion Lumos MS 仪器中的 SPS MS3 方法来获得高动态范围下的准确定量分析。此外，可以借助样品分级技术（e.g.，Thermo ScientificTM PierceTM 高 pH 反相肽段分离试剂盒，P/N 84868）来降低样品复杂度。

 

理论上还可以采用更小的隔离窗口 （0.4 Th）来提高 Q Exactive Plus MS 或 Q Exactive HF MS 的定量分析精度，但是其定量灵敏度也会受到影响。

 

图 19. 不同隔离窗口的定量分析精度，用可定量肽段组的定量比值中位数来表示。

 

总体来说，要在任何 Q Exactive 系列质谱仪上进行成功的 TMT 实验，都需要根据样品特点仔细选择相关参数。要达到高灵敏度和高精度的定量分析目标，建议考虑以下因素：
1）采用更长的洗脱梯度、更长的柱子和更高上样量。
2）为不同 TMT 标签调整 MS2 分辨率设置。
3）让最大注入时间与分辨能力相匹配以实现最优的质谱工作循环。
4）根据标签数提高 AGC MS2 目标，TMT10plex 最高可以设为 1e5。
5）在不会过度碎裂肽段的前提下提高 NCE 。
6）四极杆相对于传统方法更窄的母离子隔离窗口，更适合鸟枪法（shortgun）测序的应用。

 

结论

TMT 标记能够提高样品分析通量并支持高达十个不同的生物样品的相对定量，包括细胞、组织和体液。本研究用 TMTsixplex 和 TMT10plex 标记的 E. coli 细胞裂解液样品评估了 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 仪器在蛋白质/肽段鉴定效率和定量分析精度方面的性能。

Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 非常适合分析中低复杂度的样品。而对于高复杂度样品来说，最好能采用预分级的方式以提高定量分析精度和准确度。通过比较并优化多组不同参数设置，包括 MS2 分辨能力、最大注入时间、自动增益目标值和隔离窗口等，实现了最高的鉴定效率和最准确的定量分析。同时，本文还详细介绍了样品前处理和液相色谱等相关设置，以及如何采用 Proteome Discoverer 软件 2.1 版本进行数据处理的方法和流程。

 

参考文献
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12. Viner, R. et al. Thermo Fisher Scientific Application Note 566.
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14. Arrey, T. et al. Thermo Scientific Poster Note 64412.

 

  

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