威斯腾原代细胞培养经典案例和细胞药筛介绍

2017-01-18 来源:本站点击次数:8543

威斯腾原代细胞培养和细胞药筛

威斯腾生物经过10多年的发展，获得了上百种细胞株和四十余钟原代细胞培养经验，并建立了庞大的细胞库及原代培养资料库；细胞平台有资深实验员、规范的SOP操作文件，万级净化细胞房，这些条件为保质保量完成每个客户的实验提供了保障。

同时，威斯腾生物结合多年原代及传代细胞培养经验，结合平台已有的技术优势，建立了完善的体外药筛实验，并引进RTCA（Real-time cellular Analysis，实时无标记细胞记录仪），在药筛过程中，全程实时记录细胞真实状况，为药筛提供最真实精准的实验数据。

威斯腾生物与上海中科院生物与细胞所化学生物学技术平台合作，享有英国国家医学研究院科技转化部MRCT独家提供的约1万种核心结构小分子化合物库资源，基于成药性结构设计，特别适于进行以新药研发为目的的活性化合物筛选。精选SiRNA库，包含20个亚库，可根据需求定制提高通路筛选。

原代细胞培养经典案例

1、淋巴细胞的原代培养

淋巴细胞主要来源：脾脏、外周血

分离方法：Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各成分的比重存在差异，因此得以分离。

分离效果：单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。

步骤：

1）眼球取血，将血液滴入肝素抗凝管中，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。

2）取淋巴细胞分离液2mL于15mL灭菌离心管中待用。

3）吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。

4）室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。

5）小心吸取中间呈白膜状的淋巴细胞层，尽量全部吸出。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

6）去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。

7）用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：活性应在95％以上。

8）接种后培养，条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。3d后，每48h添加等体积的新鲜培养基。

淋巴细胞

2、乳鼠心肌细胞的原代培养

原理：

乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞。心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%，用酶消化法将心肌组织碎块经纯化分离成单个心肌细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，内心肌细胞可达95%，在体外适宜条件下，使心肌细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。在乳鼠心肌细胞培养实验中能直接观察到培养心肌细胞生命活动的动态过程，还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。

步骤：

1）新生乳鼠剪开胸，取心尖部位。

2）剔除周围结缔组织，将心脏置于无菌平皿中，将心脏尽量剪碎，平皿内加入适量0.125%的胰酶，在37℃培养箱中，采用分次消化，每次消化5min，一共消化8-10次。
3）每次消化后取上清液，中和胰酶的消化，防止消化过度。用200目过滤筛过滤混合液。离心后收集沉淀，用PBS再次重复离心3次。用细胞培养基将细胞沉淀重悬，接种于细胞培养瓶中培养。

4）培养90min左右，将未贴壁的细胞悬液吸出。此时已经贴壁的是心肌成纤维细胞。

5）将未贴壁的细胞悬液放入新的培养瓶中继续培养，并每日观察心肌细胞的生长。

心肌细胞48h

3、神经元细胞原代培养

步骤：

1）出生 2 d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2）在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。

3）用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液（DMEM＋10％FBS）的离心管内终止消化液作用5min。

4）用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。

5）将所收集的上清经200目筛网过滤。

6）过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋20％FBS）并吹打成单细胞悬液。

7）细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内，放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

皮层神经元

4、小鼠血管平滑肌细胞（组织贴块法）

试验方法：组织贴块法

步骤：

1)颈椎脱臼处死小鼠，开胸、腹腔，暴露心脏剪取胸主动脉
2)用镊子轻轻剥离血管外结缔组织
3)用眼科剪沿纵轴剪开血管条，无菌镊轻轻刮除内膜
4)用镊子钝性加压刮中膜,待出现裂口后夹住中膜将其取出
5)将取下的中膜加入含 20%FBS 的 DMEM 培养液，用眼科剪剪碎成血管条；
6)用无菌滴管将组织块吸入细胞培养瓶，均匀铺于瓶壁，间距约 0.2～0.5cm；
7)将培养瓶直立放置于培养箱；1h 后轻轻放平
8) 每 3d 换液 1 次； 3～8代用于后续实验

血管平滑肌细胞

5、中心可提供的原代培养种类

中心可提供原代培养种类（部分）
呼吸系统	肺微血管上皮细胞肺成纤维细胞气管上皮细胞
循环系统	心肌细胞心肌成纤维细胞主动脉平滑肌细胞主动脉内皮细胞
消化系统	肠平滑肌细胞食管上皮细胞胃上皮细胞
泌尿系统	肾系膜细胞肾小管上皮细胞膀胱逼尿肌细胞
脑、神经系统	大脑皮质神经元大脑海马神经元胶质细胞微血管内皮细胞
骨、关节、肌肉系统	骨髓间充质干细胞成骨细胞破骨细胞软骨细胞
生殖系统	子宫内膜上皮细胞
眼耳鼻喉口腔系统	牙源性间充质细胞视网膜微血管内皮细胞
血液、淋巴系统	外周血淋巴细胞 DC细胞 NK细胞等

药物筛选

高内涵筛选：通过高内涵细胞分析仪在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。

高通量筛选：以为扮形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，通一时间检测数以千万的样品，并有相应数据库支持运转，微量、快速、灵敏、准确。

高内涵细胞分析仪Opera

高内涵细胞分析仪Operetta

高通量自动化药物筛选实验平台

高通量自动化siRNA文库实验平台

中心可制备的原代培养细胞（部分）

原代细胞名称	来源	分离时间	鉴定指标	鉴定方法
大鼠脑星形胶质细胞	大鼠	3-4h	胶质纤维酸性蛋白(GFAP)	IHC/IF
大鼠皮层神经元细胞	大鼠	3-4h	神经元特异性烯醇化酶(NSE)	IHC/IF
骨髓间充质干细胞	大鼠/小鼠/兔	3-4h	CD44+CD34-	流式表面抗原检测
小鼠小胶质细胞	小鼠	3-4h	Iba1	IHC/IF
大鼠血管内皮细胞	大鼠	3-4h	Ⅷ因子相关抗原	IHC/IF
大鼠膀胱逼尿肌细胞	大鼠	3-4h	α-SM-Actin	IHC/IF
大鼠心肌细胞	大鼠	4-5h	α-actin	IHC/IF
大鼠心肌成纤维细胞	大鼠	3-4h	a-SA抗体	IHC/IF
小鼠血管平滑肌细胞	小鼠	3-4h	肌动蛋白α-SMA	IHC/IF
大鼠牙源性间充质细胞	大鼠	3-4h	波形丝蛋白（vimentin）角蛋白（keratin）	IHC/IF
小鼠脾脏淋巴细胞	小鼠
小鼠巨噬细胞	小鼠
小鼠附睾精子细胞	小鼠
老年鼠脂肪间充质干细胞	老年鼠	3-4h	D44+CD45-	流式表面抗原检测
瘢痕组织成纤维细胞	瘢痕组织	3-4h	波形蛋白	IHC/IF
大鼠皮层神经元干细胞^﹡	大鼠	3-4h	Nestin	IHC/IF
骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）^﹡﹡	骨髓	3-4h	CD34与CD133	IHC/IF
﹡：神经元干细胞原代培养通常需要额外的细胞因子如B-27、EGF、bFGF
﹡﹡：EPCs原代培养需要特殊培养基

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