彭兴，朱曼洁   赛默飞世尔科技（中国）有限公司

摘 要
本研究基于气相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（Thermo Scientific TM Q Exactive-GC），并结合相应的数据处理软件，研究精确质量数据库建立以及利用数据库进行目标化合物快速筛查的流程。实验中的数据，均在60,000 FWHM（200m/z）及以上的分辨率下采集，且数据的质量准确度保证在2ppm范围内，所以，其超高的性能特点保证了数据的准确性和可靠性。快速筛查方法同时对精确质量数偏差、保留时间窗口、同位素分布与同位素丰度信息等参数进行了优化，最大程度的降低假阳性以及假阴性结果的干扰，从而获得最准确的筛查结果。

关键词 Q Exactive-GC；高分辨精确质量数据库；目标化合物筛查

1.引言
随着检测技术的发展，在食品安全、环境监测、司法等领域，对于快速筛查方法的需求越来越迫切。少量化合物检测以及大量特定目标性化合物的筛查方法已无法满足高通量、快速筛查的要求。三重四极杆作为常见的检测手段，一般采用多反应监测（MRM）的扫描模式，由于其需要固定目标化合物的数据库，所以其对于高通量快速筛查方面仍有一定的局限性。高分辨质谱由于其分析速度快、质量精度高和分辨率高等特点，使其在快速筛查方面具有较大的优势。但是常规的高分辨质谱如飞行时间质谱又通常受限于灵敏度低、定量范围窄以及稳定性不好等方面的问题，无法真正满足用户的需求。
静电场轨道阱（Orbitrap）在具备常规高分辨质谱特性的同时，其分辨率更高，质量稳定性更强，同时具有高灵敏度，满足痕量检测需求；具有宽的动态定量范围，利于低浓度和高浓度化合物的同时定量；仪器稳定性高，可保证长期检测的可靠性。
Q Exactive-GC 采用先进的静电场轨道阱（Orbitrap）检测技术，分辨率高达 120,000 FWHM（200  m/z ），同时保持良好的灵敏度。Q Exactive-GC 可进行高分辨数据全扫描采集，同时保证了数据的可溯源性，最大限度地对样品特性进行相关挖掘，分析。利用 Q Exactive-GC 进行目标化合物快速筛查，通常需要结合相关的高分辨精确质量数据库。当分辨率高于 50,000 FWHM（200  m/z ）时，高分辨全扫描方式的选择性会优于三重四极杆质谱 MRM 的扫描模式，即交叉点 [1] 。因此，Q Exactive GC 高分辨质谱参数选择了 60,000 到 120,000（200  m/z ）的分辨率进行目标化合物快速筛查。
本研究基于 Thermo Fisher Scientific 最新气质高分辨产品Q Exactive-GC，探索了精确质量数据库建立以及结合数据库进行筛查的相关流程。

2.实验部分

2.1 质谱条件
仪器型号：Thermo Scientific TM Q Exactive-GC 质谱仪
离子化类型：EI（电子轰击）
离子源温度：280 ℃
电子能量：70 eV
采集模式：高分辨全扫描（FullScan）
质量分辨率：60,000 FWHM（200  m/z ）；120,000
FWHM（200  m/z ）
扫描范围：50-700  m/z

2.2 数据采集及数据库建立流程
1) 配置化合物标准溶液，浓度为 2.0 mg/L（溶剂正己烷）；
2) 全扫描模式进样分析，分辨率 60,000 FWHM（200  m/z ）
或 120,000 FWHM（200  m/z ）；
3) 数据文件经解卷积软件处理；
4) 获得各个化合物离子碎片理论精确质量；
5) 编入数据库。

3.实验与结果
3.1 数据文件处理
数据文件采用新一代解卷积软件进行处理。经解卷积后，可从多个叠加图谱中快速分离、提取单一化合物谱图信息，去除干扰及背景离子，从而获得相对纯净的质谱图。同时，解卷积软件还可结合 NIST 谱库进行离子匹配及碎片离子理论质量数计算，得到更加准确的定性信息。
解卷积及谱库检索流程主要包括：① 数据文件解卷积；② 计算精确质量数；③ 谱库检索。如图 1 所示。

3.2 数据库建立
Q Exactive-GC 采用电子轰击（EI）离子源，其电离效率高，可将化合物打碎产生多个碎片离子，提供了丰富的谱图信息。Q Exactive-GC 采用全扫描采集模式，结合自身高分辨率及高质量精度，获得的数据更为精确、可靠。在建立 Database 时，通常选取响应较高的碎片离子作为定量离子和定性离子。
EI 质谱图可提供丰富了谱图信息。建立 Database 时，通常选取 2-5 个碎片离子录入数据库。以基峰离子做为定量离子，其余的离子为定性离子。同时提供了基峰离子的化学式，软件可根据化学式自动进行同位素拟合，对比各个同位素的精确质量数及丰度，提供更为确切的筛查信息。Database 主要包含化合物名称、CAS 登记号、碎片离子信息（精确质量、化学式）、保留时间等信息。
按照欧盟方法学标准，质谱方法必须达到 4 个定性点的确证要求 [2] ，对于三重四极杆串接质谱，通常只检测 2 对离子对，因此其定性点往往只有 4-5 个；而对于高分辨质谱，由于其对精确质量数进行全扫描测定，因此其每个离子被定义为 2 个定性点，相对丰度在基峰强度 10% 以上的离子均可作为定性离子。
按照以上规则，Q Exactive-GC 所采集数据的定性点均在 4 个以上，并可以实现全扫描图谱的库检索工作。利用 TraceFinder 3.3可快速建立精确质量数据库（Database），并且可利用数据库进行相关检索。数据库如图 2 所示。

3.3 快速筛查流程
3.3.1 目标化合物筛查流程
利用 Q Exactive-GC 高分辨率、高质量精度、高灵敏度等优异性能，结合高分辨精确质量数据库进行快速筛查，不受目标化合物数量的限制，从而达到高通量、快速筛查的目的，并满足低浓度化合物检测和数据回溯性研究。
利用化合物的精确质量数据库和保留时间，同时结合同位素强度、同位素分布等信息，建立了目标化合物筛查流程。如图 3 所示。

3.3.2 筛查参数设置
Q Exactive-GC 筛查方法主要涉及精确质量数据库的选择、保留时间参数设置、精确质量数据参数设计、同位素模型参数设置等方面。通过参数的设置，达到快速、准确筛查的目的，如图 4 所示。


采用固定的色谱柱、气相色谱方法，可以保证化合物统一的保留时间。通过保留时间的限制，尽可能的将化合物在色谱上进行分离，再结合精确质量数据库可达到更可靠的筛查效果。
Q Exactive-GC 超高分辨率以及高质量精度，使测定的数据可信度更高。在筛查过程中，准确、稳定的数据保证了筛查结果的确定性、唯一性。实验中，通过对400余种农药化合物选取的1345个碎片离子精确质量数的研究，其实测值与理论值的质量偏差均在1ppm范围内[3]，如图4所示。Q Exactive-GC在大量的数据采集过程中能保持良好的质量偏差，进而实现了通过尽可能低地限制质量偏差以减少假阳性结果。

除了保留时间、精确质量、质量偏差等标准参数，目标化合物筛查流程还引入了同位素拟合的概念，将实际值和理论同位素值进行对比，增加、完善了判断条件。这主要是因为化合物具备的同位素簇信息对于定性具有重要意义。例如 Cl 和 Br，其同位素贡献占到了 32.0% 和 97.3%，并且随着化合物中元素个数的增加，同位素贡献呈现上升的趋势。
TraceFinder 3.3 可根据离子的化学式自动生成相应的同位素峰理论信息，自动与测定值相比较。化合物的同位素分布与同位素丰度信息在检索中的得分作为筛查的一项重要参数和判断依据。如图 5 所示。


3.5 筛查结果浏览及导出报告
TraceFinder 3.3 筛查结果的浏览采用了简单、直观的“交通信号灯”模式，结果展示更清楚直观。如图 8 所示，符合筛查结果中参数设置的项目可清晰显示，便于使用者查看。


同时，筛查结果可快速转化成常见数据格式（XLS, PDF, CSV 等）快速预览、生成、导出。用户也可根据不同的检测需要选择默认模板和自定义报告模板，快速生成相关的实验结果。

4.结论
目标化合物筛查是 Q Exactive-GC 在食品安全、环境监测、毒物检测等领域的主要应用。利用仪器超高分辨率、稳定的质量精度以及高灵敏度与 TraceFinder 软件结合，可以快速建立化合物精确质量数据库，利用化合物的精确质量数与保留时间，同位素强度，同位素分布等信息结合，对样品进行快速筛查。

参考文献
[1]. Comprehensive comparison of liquid chromatography selectivity as provided by two types of liquid chromatography detectors (high resolution mass spectrometry and tandem mass spectrometry): “Where is the crossover point?” A.Kaufmann et al. / Analytica Chimica Acta 673 (2010) 60-72
[2]. 《EC 657-2002》
[3]. 彭兴，朱曼洁，李春丽，芦苓. 基于 Q Exactive-GC 精确质量数据库筛查及确证食品中 435 种农药多残留. 赛默飞世尔科技.