聂爱英

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

 

LTQ-Orbitrap Elite；单抗药物；分子质量分析；氨基酸序列分析；糖基化位点分析

 

单抗药物主要是由两条重链和两条轻链通过链内和链间二硫键以及非共价键组成，分子质量大约在 150 kD 左右，每条重链和轻链在 N 端都包含一个可变区域，在 C 端都包含一个恒定区域，并且在每条重链上还存在一个 N 糖基化位点，该位点含有不同的糖链结构，如图 1 所示。目前，在生物制药领域中，单抗药物以其高效的治疗靶向性和特异性，越来越受到制药公司和医疗单位的青睐。为了保证单抗药物的有效性，以及单抗药物生产过程的实时监控，对于单抗药物的整体分子质量的测定、氨基酸序列的鉴定，糖基化位点的确认，二硫键的定位，糖链结构的解析等重要的分析技术，越来越受到制药公司的关注。随着生物质谱技术的不断发展和推广，基于生物质谱的单抗分析技术也开始全面、快速的开展起来。

 

目前，LTQ-Orbitrap Elite 组合式质谱仪结合了以前的双压线性离子阱质谱仪和新型高场 OrbitrapTM 质量分析器，提高了 MS和 MSn 的性能和多功能性。该系统具有高于 240,000 的分辨率（FWHM）、更高的灵敏度、高扫描速度和更大的动态范围，同时结合了多种碎裂技术，为深度复杂样品分析，包括蛋白质组学、代谢组学、脂类组学等样品的鉴定，翻译后修饰和定量分析，提供了全面、高效和快速的质谱分析平台。

 

 

图 1. 单抗药物的简单结构示意图（V 表示可变区域，C 表示恒定区域，L 表示轻链，H 表示重链。）

 

2.1.1 仪器和试剂

质谱仪器：LTQ-Orbitrap Elite（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱仪器：Accela 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：BioBasic 色谱柱（C8, 1×100 mm，5μm，300 Å）

（赛默飞世尔科技，美国）；

试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸。

2.1.2 仪器方法

色谱分析条件：具体见表 1；

质谱分析条件：具体见表 2；

2.1.3 数据分析方法

采用 Protein Deconvolution 2.0 软件对原始质谱图进行去卷积处理，得到完整的蛋白质分子质量信息。

 

表 1. 单抗分子质量测定的色谱分析条件

 

 

表 2. 单抗分子质量测定的质谱分析条件

 

 

2.2.1 仪器和试剂

质谱仪器：LTQ-Orbitrap Elite（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱仪器：Easy-nLC 1000液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：Nano 色谱柱（C18，75μm × 150 mm，2 μm,100Å）（赛默飞世尔科技，美国）；

试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸，PNGaseF 内切糖苷酶，二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 内切蛋白酶。

 

2.2.2 仪器方法

色谱分析条件：具体见表 3；

 

质谱分析条件：具体见表 4；

 

表 3. 氨基酸序列测定的色谱分析条件

表 4. 氨基酸序列测定的质谱分析条件

 

2.2.3 数据分析方法

采用 Proteome Discoverer 1.3 软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列的数据库；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）设置为固定修饰；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脱氨基化（+0.984Da）设置为可变修饰；trypsin 设置为酶；酶漏切位点为 2。设置肽段的置信水平为 99%，得到高置信的鉴定肽段和蛋白结果。

 

2.2.4 样品前处理方法

将单抗样品首先进行 PNGaseF 酶解，切除糖链后的蛋白质，再进行 DTT 还原和 IAA 烷基化，最后进行 trypsin 过夜酶解。

 

2.3.1 仪器和试剂

质谱仪器：LTQ-Orbitrap Elite（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱仪器：Easy-nLC 1000 液相色谱系统（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：Nano 色谱柱（C18，75 μm× 150 mm，2 μm,100Å）（赛默飞世尔科技，美国）；

试剂：二次去离子水，色谱级乙腈，色谱级甲酸，二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 内切蛋白酶。

 

2.3.2 仪器方法

色谱分析条件：具体见表 3；

质谱分析条件：具体见表 4；

 

2.3.3 数据分析方法

采用 Byonic 1.1 软件对原始谱图进行数据库搜索，具体搜库参数为：包含单抗氨基酸序列和 N 糖基化结构的数据库；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）设置为固定修饰；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脱氨基化（+0.984Da）设置为可变修饰；trypsin 设置为酶；酶漏切位点为 2。最终通过人工确认，得到准确的糖基化修饰肽段的鉴定信息。

 

基于高分辨质谱 LTQ-Orbitrap Elite，为了保证采集谱图的质量和数量，我们设定高场 Orbitrap 检测器的采集分辨率为15,000。

 

经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的单抗原始质谱谱图如图 2-A所示，我们可以观察到不同的电荷分布的质谱图，选取强度最高的 m/z 为 2744.0384 的一组质谱峰为例，放大之后的质谱峰如图 2-B 所示，可以看到质谱图的灵敏度和信噪比都很高。

 

 

图 2. LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的单抗原始质谱图（A 为整体分布图，B 为 m/z 为 2744.0384 的放大图。）

 

经过 Protein Deconvolution 2.0 软件去卷积处理之后的单抗分子质量分布图（图 3），根据单抗的氨基酸序列理论分子质量进行计算，将观察到的质谱峰进行归属，可以初步推断该单抗药物存在多种形式的糖链结构，主要包括 G0、G0F、G1F 和 G2F，该结论与常见的单抗组成基本一致，同时根据质谱峰的峰强度信息，我们还可以计算得到不同糖型单抗的相对定量信息，如图 3 中蓝色数字所示。

 

图 3. LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的单抗原始质谱图经过 Protein Deconvolution 2.0 软件去卷积处理之后的单抗分子质量分布图（G0、G0F、G1F 和 G2F 表示不同类型的糖型，蓝色数字表示质谱峰所对应的峰强度和相对定量信息。）

 

经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱数据采集和 Proteome Discoverer 1.3 软件的数据库搜索，以及肽段 99% 高置信水平卡值，在 trypsin酶解实验中，单抗重链的蛋白序列覆盖度为 97 %，如图 4-A 所示，轻链的蛋白序列覆盖度为 98 %，如图 4-B 所示，由此证明LTQ-Orbitrap Elite 质谱可以准确、有效地实现单抗氨基酸序列的成功鉴定。其中未鉴定到的氨基酸序列主要是由于酶切后肽段过短不适合质谱鉴定所造成的，为了实现 100% 的氨基酸序列覆盖，可以通过选择其它内切蛋白酶来实现。

 

单抗蛋白中一般都包含 N-糖基化修饰，也就是说肽链的天冬酰胺（Asn，N） 残基可以与糖链的还原端连接，形成不同糖链结构的糖基化蛋白，一般发生 N-糖基化修饰的位点都是在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 为除脯氨酸外的任意氨基酸）。在经过内切糖苷酶 PNGase F酶切后，天冬酰胺（Asn，N）残基会丢失糖链，产生 0.984 Da 的质量增加。不过在样品处理过程中也可能会导致天冬酰胺、谷氨酰胺发生脱氨基化，同样会使天冬酰胺产生 0.984 Da 的质量增加。最终的搜库结果显示一些天冬酰胺残基存在0.984 Da 的质量增加，这可能是由于样品发生了脱氨基化或者 N 糖链被酶解所致，进一步结合 N 糖基化位点的特定 NX(X≠P)S/T结构域信息，我们初步推断该单抗中唯一可能发生糖基化的位点为：重链中氨基酸序列 EEQYNSTYR 中的 N 位点，为了得到准确的定性结果，我们进行了后续的糖基化位点鉴定实验。

 

 

图 4. 单抗经过 trypsin 酶解和 LTQ-Orbitrap Elite 质谱实现的氨基酸序列覆盖度示意图（A为重链氨基酸序列覆盖示意图，B 为轻链氨基酸序列覆盖示意图，其中绿色标记的氨基酸序列表示该段序列鉴定的可靠性非常高，达到 99% 以上，红色标记的氨基酸序列表示该段序列鉴定的可靠性为 95% 以下，无颜色标记的氨基酸序列表示该段序列没有被鉴定到，氨基酸序列上方的数字代表氨基酸的位置。）

 

经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱数据采集和 Byonic 1.1 软件的数据库搜索，共鉴定到 6 个糖基化修饰的肽段，分别对应于 G0（ ）、G0F（ ）和G1F（ ）（红三角表示岩藻糖，蓝方块表示 N-乙酰氨基葡萄糖，绿圆表示甘露糖，黄圆表示半乳糖）等，每一条糖肽都经过人工确认，以其中的 EEQYN（G0F）STYR 糖肽为例，如图 5 所示，在二级质谱中，可以观察到 6 个糖诊断离子（见表 5）和 8 个糖肽碎片离子（见表 6），同时结合 N 糖基化修饰位点的特定结构域信息，从而确证该肽段中天冬酰胺（N）残基为 N-糖基化修饰位点。

 

由于采用了高分辨、高精度的 LTQ-Orbitrap Elite 质谱，糖诊断离子的质量偏差都在 1 ppm 以内，除了个别碎片离子外，基本所有的糖肽碎片离子的质量偏差也都在 1 ppm 以内，由此可以判断该糖肽碎片离子的归属准确、可靠。

 

表 5. EEQYN（G0F）STYR 糖肽经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱鉴定到的糖诊断离子列表

 

表 6. EEQYN（G0F）STYR 糖肽经过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱鉴定到的糖肽碎片离子列表（红三角表示岩藻糖；蓝方块表示N-乙酰氨基葡萄糖；绿圆表示甘露糖）

 

图 5. LTQ-Orbitrap Elite 质谱采集的 EEQYN（G0F）STYR 糖肽的二级质谱图（红三角表示岩藻糖；蓝方块表示 N-乙酰氨基葡萄糖；绿圆表示甘露糖）

 

本文通过 LTQ-Orbitrap Elite 质谱建立了单抗药物的整体分子质量测定、氨基酸序列鉴定和糖基化位点确认的分析方法，为常规单抗药物研发分析和实时生产检测提供了高效、快速的分析平台。实验结果表明 LTQ-Orbitrap Elite 组合式质谱仪，凭借其超高的分辨率，超快的扫描速度，超高的质量精度、超低的灵敏度和超大的动态范围，极大地完善和推动了单抗药物的鉴定分析。