张晓夕1, Sutton, Jennifer N.2

1 赛默飞世尔科技（中国）有限公司

2 Thermo Fisher Scientific, West Palm Beach, FL, USA

 

在蛋白质药物产品的质控要求中，肽图分析是其中重要的一环。肽图分析包括对蛋白氨基酸序列进行确证及相关修饰的鉴定和定量。根据蛋白药物质谱分析特点和生物制药应用的特殊需求，Thermo Fisher与Amgen联合开发了PepFinderTM 软件。

 

PepFinder不仅具有最基本的肽段序列确证、覆盖率分析、修饰位点鉴定与定量、二硫键分析、图谱对比和肽段CID/HCD/ETD谱图解析等功能，还具有其独特功能，如未知修饰搜索功能和氨基酸突变搜索功能[1-5]。这两项功能可以帮助分析人员快速发现可能出现的序列突变，从而大大降低出现质量风险的几率。同时，PepFinder还有更多实用的功能设计，如内置CHO细胞系糖型、具有肽段鉴定可信度评价功能，还可根据碎裂方式和能量智能预测多肽的理论碎裂谱图，并用于与实验图谱直观对比，以辅助分析。这些功能不但减少工作强度，也降低了对分析员理解质谱数据深度的要求。对于氨基酸固定修饰设置，不同于其它类似软件（固定修饰只可精确至某一类氨基酸），在PepFinder中，可以精确到特定的某个氨基酸位点。 此功能对于蛋白药的某些特殊分析需求提供了极大的便利。

 

 

图1显示了PepFinder搜库得到的序列覆盖度结果，图中不同颜色代表信号强度。从图中可以看出，单抗标准品的轻重链覆盖度均达到了100%；PepFinder还可对脱酰胺进行定量，这对于生物医药分析人员是非常有用的。图2显示了PepFinder生成的修饰情况总结；图3展示了一条包含脱酰胺修饰肽段SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK的定性以及定量情况。

 

在PepFinder软件的2.0版本中，加入了De Novo（从头测序，指对于没有蛋白序列的物种，根据质谱碎片信息利用生物信息学计算，对序列重新拼接和组装，以得到蛋白序列的技术）功能，可对所有肽段进行De Novo Sequencing（图4），或单独对某一张MS/MS谱图对应的肽段进行De Novo Sequencing（图5）。

 

在PepFinder2.0软件中，新增了 mgf格式文件输出功能，供MASCOT用户进行HCP分析；还新增了Pinpoint txt文件输出功能，供Pinpoint用户进行蛋白绝对定量；方便生物制药用户使用不同软件对数据进行深度分析，大大减少工作人员在数据处理上耗费的时间和精力。

 

从图3中可以看出，使用PepFinder软件可获得连续的肽段碎片离子，提高了鉴定结果的可靠性；分别对N416和N429两个可能发生脱酰胺修饰的位点进行定量，可以得到N416的脱酰胺比例为2.28%，N429的脱酰胺比例为2.90%。对于生物医药行业分析人员，脱酰胺修饰量的变化是药物稳定性测试的重要参数，PepFinder软件可提供精确到位点的脱酰胺定量信息，为分析人员提供有力参考。

 

在PepFinder软件中，只要导入单克隆抗体的序列，即可自动计算出该抗体的重链末端K丢失后分子量、还原后（未还原）轻/重链分子量、无糖/脱糖重链分子量和各种常见糖型重链分子量等（图6）；目前，此功能为PepFinder软件独有，其他类似软件尚无此功能。

 

PepFinder软件还可对二级谱图进行预测，在类似软件中，PepFinder软件预测得到的二级谱图最接近真实碎裂的谱图（图7）。

 

 

图1 PepFinder序列覆盖度结果

 

 

图2 PepFinder生成的修饰情况总结

 

 

图3 肽段SNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEK的脱酰胺鉴定及定量

 

 

图4 在PepFinder2.0中对所有肽段进行De Novo Sequencing

 

 

图5 对一张MS/MS谱图进行De Novo Sequencing

 

 

 

图6 在PepFinder软件中计算单克隆抗体各种常用分子量

 

 

图7 PepFinder软件预测的二级谱图与实测二级谱图的对比。上，预测二级谱图；下，实测二级谱图。

 

在本文中，我们展示了PepFinder软件对单克隆抗体进行常规肽图分析的各种应用。结果表明，使用PepFinder软件可以简便快捷的得到序列覆盖度分析的结果，并且可以对脱酰胺等生物医药质控中重要的翻译后修饰进行鉴定以及定量。PepFinder独具的单克隆抗体分子量计算功能及二级谱图智能预测功能大大减少了分析人员花费在数据处理上的时间；在PepFinder2.0版本中，新增的De Novo Sequencing功能和mgf格式文件、pinpoint txt文件输出功能帮助分析人员对数据进行不同平台上的深入挖掘。通过生成快速、全面的肽段表征及自动化的修饰位点总结报告， PepFinder 软件能够大幅减少生物产品详细表征所需的时间和精力。

 

1. Z. Zhang, Automated Precursor Ion Exclusion During LC/MS/MS Data Acquisition for Optimal Ion Identification, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23(8), 1400-1407.

2. Z. Zhang, Large-scale Identification and Quantification of Covalent Modifications in Therapeutic Proteins. Anal. Chem. 2009, 81(20),8354-8364.

3. Z. Zhang and J. S. Mcelvain, Optimizing spectroscopic signal-to-noise ratio in analysis of data collected by a chromatographic /spectroscopic system, Anal. Chem. 1999, 71(1),39-45.

4. Z. Zhang and A. G. Marshall, A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray-to-charge ratio spectra, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998, 9, 225-233.

5. Z. Zhang, Retention time alignment of LC/MS data by a divide-and-conquer algorithm, J. Am.Soc. Mass Spectrom. 2012, 23(4), 764-772.

6. SC. Kim, Y. Chen, S. Mirza, et.al. A clean, more efficient method for in-solution digestion of protein mixtures without detergent or urea. J Proteome Res. 2006 Dec;5(12):3446-52.