张伟*

(赛默飞世尔科技(中国)有限公司, 上海201206)

 

摘要 质谱是定量蛋白组学的主要工具。近年来随着定量蛋白质组学研究的深入,传统质谱定量技术面临着复杂基质干扰、分析通量限制等诸多问题。而最近一系列质谱新技术的发展,包括同步母离子选择(SPS)、质量亏损标记、平行反应监测(PRM)、多重累积(MSX)和多种全新数据非依赖性采集(DIA)等,为解决目前蛋白质组学在相对定量和绝对定量分析方面的局限提供了有效途径。本文对定量蛋白质组学目前遇到的瓶颈问题进行了分析,总结了质谱定量采集技术的最新进展,并评述了这些新技术的特点以及在定量蛋白质组学应用中的优势。

 

关键词 定量蛋白质组学; 同步母离子选择; 平行反应监测; 数据非依赖性采集; 综述

 

 

当今蛋白质组学的关注焦点和研究趋势已经逐渐从定性分析转向定量分析。定量蛋白质组学是对细胞、组织乃至完整生物体的蛋白质表达进行定量分析,对生物过程机理的探索和临床诊断标志物的发现与验证具有重要意义[1,2] 。定量蛋白质组学分为相对定量与绝对定量[3] 。相对定量即差异比较,通过质谱大规模、高通量地对两种或多种不同生理、病理条件下的样本进行定量分析,获得蛋白质表达量的精确差异,主要方法有稳定同位素标记和非标记两种技术手段[4,5] 。绝对定量即获得蛋白的具体表达量,利用质谱监测目标蛋白的专一性肽段(Unique Peptide)获得色谱-质谱峰面积,并与已知量的标准肽段(外标法)或稳定同位素标记的重标肽段(内标法)比较确定具体量,实现绝对定量。主要质谱方法是对专一性肽段进行选择反应监测或称多反应监测(Selected/ Multiple reaction monitoring, SRM/ MRM)[6] 。

 

稳定同位素标记技术是蛋白质组学相对定量的经典方法。样本在稳定同位素标记后、质谱分析前混合,一次分析实现差异定量,有效消除了色谱和质谱分离分析过程中的不稳定性,最大程度减小了定量误差。常见方法有基于代谢标记的SILAC[7] 、基于酶解标记的18 O 标记[8] 和基于化学标记的二甲基化[9] 等,这些方法通过一级母离子提取峰面积实现定量比较。但是,一级定量具有标记通量低、动态范围差、灵敏度不高等不足,因此, 近年来,基于同重同位素标记的二级定量方法使用越来越广泛[10] 。利用同重同位素标签标记肽段,在一级质谱不同样本的肽段分子量没有区分,相互叠加,提高了灵敏度;二级碎裂获得分子量不同的报告离子,在b/ y 离子定性的同时,通过报告离子之间的强度差异实现定量,提高了动态范围。同重同位素主要标记试剂有iTRAQ[11] 和TMT[12] ,标签容量分别达到了8 标和6 标。然而,同重同位素标记技术面临共洗脱肽段干扰的问题。蛋白质组学样本非常复杂,在色谱上存在大量共洗脱肽段,而质谱在选择母离子进行二级分析时,选择窗口通常在m / z 2 左右,分子量接近的共洗脱肽段被同时选择,碎裂出的报告离子与目标肽段报告离子叠加,降低了定量比例的准确性[13,14] 。Ting 等[15] 研究证明,在复杂样本中,共洗脱肽段严重干扰了报告离子的强度,造成肽段和蛋白的定量比例低于真实比例,产生“低估效应冶。这一问题已成为同重同位素标记定量技术的瓶颈。

 

基于三重四极杆的SRM(或称MRM)是质谱定量的金标准,在蛋白质绝对定量中也广泛使用[6] 。SRM 根据专一性肽段的母离子质量和子离子质量,第一级质量分析器(Q1)筛选母离子,进入碰撞池碎裂后,第二级质量分析器(Q3)再筛选子离子,最大程度地去除干扰离子,监测母离子-子离子形成的离子对的信号响应。通过外标法,利用已知量的标准肽段绘制标准曲线; 或内标法,直接加入已知量的同位素重标肽段同时监测,从而实现定性确证和定量检测[6,16] 。SRM 灵敏度高、线性范围广,是目标蛋白验证和绝对定量的有效手段。然而,随着定量蛋白质组学的深入发展,样本基质越来越复杂、目标蛋白丰度越来越低,容易受到高丰度蛋白的掩盖。而SRM 由于质量分辨率低,难以有效去除复杂基质背景的干扰,易造成假阳性[17,18] 。另一方面,随着分析通量的要求越来越高,一次分析可能需要监测成千上万个离子对,而SRM 速度和灵敏度的局限使得能同时监测的离子对数量有限[19] ; 此外,离子对、碰撞能量等条件的优化也费时费力,难以满足目标蛋白质组学高通量发展的需要,特别是大样本量的生物标志物和系统生物学研究[20,21] 。因此,蛋白质绝对定量同样面临着较大的技术挑战。

 

近两年来,随着以Orbitrap 为代表的高分辨质谱硬件技术不断进步、采集方法不断创新,定量蛋白质组学遇到的诸多瓶颈正逐步得到解决。这些技术包括基于同重同位素标记技术的同步母离子选择和质量亏损标记,相对于传统SRM 扫描的高分辨平行反应监测和多重累积-平行反应监测,以及多种全新数据非依赖性采集技术。

 

 

以iTRAQ 和TMT 为代表的同重同位素标记技术面临着两方面的技术瓶颈:(1) 大量共洗脱肽段对定量准确性的影响:分子量接近的共洗脱肽段与目标肽段共同选择并碎裂,报告离子叠加,造成实际定量比例不能准确反映真实结果[13 ~15] ; (2) 等重同位素标签通量有限:以iTRAQ 为例,其报告基团(N-methylpiperazine)由6 个C 和2 个N 组成,因此容量上限为8 标,无法完成更高通量样本的分析[22] 。而通过增大报告基团来提升标签容量又会造成灵敏度的下降[23] 。

 

为解决共洗脱肽段干扰的问题,Ting 等[15] 使用LTQ-Orbitrap 进行MS³ 扫描,对TMT 标记的样本进行分析(图1)。其中MS² 使用能量较低的CID (35%)碎裂,获得b/ y 离子碎片用于序列鉴定,同时确保了TMT 标签不会过多碎裂。在母离子m / z 110 ~160% 的范围内,选择最强的一个碎片离子,进行高能量HCD (60%)碎裂和MS3 检测,使报告基团充分碎裂,获得报告离子比例信息。结果表明,通过母离子和子离子双重筛选,共洗脱肽段的干扰能够被彻底去除,获得的定量比例与理论比例一致。例如,在掺入等比例人源蛋白的不同比例酵母全蛋白样本中,理论比值为10颐1,传统MS² 测得的比值仅约为3,而MS³ 测的比值为11. 7,与理论比值非常接近。

 

但是与传统MS² 方法相比,MS³ 信号强度明显降低。因此,虽然MS³ 的定量准确度大大提高,但定量灵敏度却明显下降,也使得MS³ 定量方法并没有普遍应用到实际分析中[24] 。此外,近来发展的TMT互补离子(TMTc) [25] 和QuantMode[26] 等技术虽然也能降低共洗脱肽段的干扰,但过程较为繁琐,准确度无法与MS³ 方法相媲美。

 

 

图1MS³ 定量方法示意图[15] :(A) MS³ 方法质谱采集过程; (B) MS³ 与传统MS² 方法结果对比

 

Fig. 1Schematic elucidation of MS³ method[15] : (A) Acquisition workflow of MS³ ; (B) Comparison of MS³ and classic MS² results.

 

同步母离子选择(Synchronous precursor selection, SPS)技术的出现彻底解决了MS³ 响应弱的问题。SPS 技术利用多频切迹的选择波形电压(MultiNotch) [27] ,在线性离子阱中实现一次选择同时获得多个离子,最多可同时选择15 个(图2A)。利用这一原理,SPS 技术在MS² 中同时选择目标肽段的多个b/ y碎片进行MS³ 分析,产生的报告离子相累积,使MS3 信号响应大幅提高(图2B)[24,28] 。实验结果表明,使用SPS 进行MS³ 定量分析,即二级CID 碎裂,并同时选择多个碎片离子进行三级HCD 碎裂和Orbi-trap 检测,获得的MS³ 谱图响应与传统MS2 谱图相当,定量成功率超过70%,与传统MS² 定量结果相当(图2C)[24,28] 。同时,多个碎片报告基团的叠加相比传统MS³ 单个碎片报告基团,得到的比值更加稳定,定量重现性和准确度进一步增加(图2D)。此外,相比传统方法,MS³ 定量方法只能用于Lys-C 酶解样品,SPS MS³ 定量方法适用于广泛使用的Trypsin 酶解样品,能更普遍用于常规定量蛋白质组学[29] 。Weekes 等[30] 使用SPS MS³ 技术定量研究了巨细胞病毒(CMV)感染纤维母细胞的过程和机理,获得超过8000 个蛋白(包括1184 个细胞表面蛋白)在8 个时间点感染过程中的精确定量变化,实现了实时动态定量分析,开创了定量时序病毒组学(Quantitative Temporal Viromics)领域的先河。

 

 

图2 SPS MS³ 定量方法示意图[24,28] :(A) SPS MS³ 方法质谱采集过程; (B) 传统MS² 、MS³ 、SPS MS³ 对报告离子的影响; (C) MS³ 、SPS MS³ 定量灵敏度对比; (D) 传统MS² 、SPS MS³ 定量准确度对比

 

Fig.2 Schematic elucidation of synchronous precursor selection (SPS) MS³ method [24, 28] :(A) Acquisition workflow of SPS MS³ ; (B) Influence of classic MS2 ,MS³and SPS MS³ for reporter ion intensity; (C) Comparison of sensitivity of MS³ and SPS MS³ ; (D) Comparison of accuracy of classic MS² and SPS MS³

 

对于同重同位素标签通量的限制,Dephoure 等[31] 尝试使用3 标SILAC 结合6 标TMT,同时定量18 组平行样本,取得了良好的效果。而近年来,质量亏损标记技术的运用,从根本上拓展了报告基团的标签容量。¹³C 和¹²C、¹⁵N 和¹⁴N 之间因核结合能形成质量亏损,巧妙利用¹³C¹⁴ N 与¹²C¹⁵N 之间6. 32 mDa的微小质量差,通过¹³C 与¹⁵N 相互替换,即可实现标签容量上限的突破(图3A)。例如,将TMT 6 标中TMT127、TMT129 报告基团上一个¹³ C 替换成¹⁵ N,形成TMT127L (¹² C₈ H₁₆ ¹⁵N¹⁺ , 127. 1247608 Da) /TMT127H (¹²C₇¹³C₁H^₁₆14N¹⁺ , 127. 1310808 Da), TMT129L (¹²C₆¹³C₂H₁₆¹⁵N¹⁺ , 129. 1314705 Da) /TMT129H (¹²C5 ¹³C₃H^{16 14}N¹⁺ , 129. 1377904 Da),标签容量提升至8 标[32] 。类似地,在不改变报告基团结构的情况下,TMT 10 标、TMT 18 标均得以实现,有效解决了多组平行样本的定量分析问题[33, 34] 。但是另一方面,6.32 mDa 的质量差异需要质谱在m / z 100 ~200 范围达到50000 以上的分辨率才能实现基线分辨(图3B),普通高分辨质谱难以胜任[33] 。而基于傅里叶变换原理的超高分辨Orbitrap 和FT-ICR,分辨率与m / z 成反比,能够轻松分辨m / z 100 ~200 的质量亏损标签[34] 。目前,基于质量亏损标记的TMT 10 标已经商品化,广泛应用于系统生物学和临床标志物研究等大样本量的定量蛋白质组学(图3C)。

 

 

图3质量亏损标记提升标签通量[33] :(A) 质量亏损标记原理(TMT-10); (B) 区分6 mDa 所需的质量分辨

率; (C) 质量亏损报告离子质谱示意图(TMT-10)

 

Fig. 3Increasing labeling capacity by mass defect isotopes [33] :(A) Principle of mass defect labeling (TMT-10);(B) Minimum resolution for discrimination of 6 mDa mass difference; (C) Mass spectrum of mass defect reporter ions(TMT-10)

 

近年来,以同步母离子选择SPS 和质量亏损标记为代表的新技术的发展,使得传统同重同位素标记定量面临的诸多问题正逐步获得解决,成为蛋白质组学相对定量的有力工具和发展趋势。

 

 

SRM 使用低分辨四极杆进行两级离子筛选和监测,在小分子分析中能有效区分目标化合物和基质背景,因为小分子的化学结构通常差异较大[35] 。然而在蛋白质组学中,由于肽段性质的相似性,SRM 难以完全排除复杂样本的背景离子,容易受到较大干扰,影响蛋白绝对定量的准确性和专一性[17,18] 。此外,SRM 还需要花费相当的精力进行离子对的选择和优化[36] 。质谱技术的改进也为SRM 带来改善。高分辨SRM (H-SRM)将四极杆的母离子选择窗口从传统的m / z 0. 7 缩小到m / z 0. 2, 从而有效地降低基质背景的干扰[37,38] 。然而,选择窗口缩小也同时降低了选择效率,因此该技术更多应用于小分子分析。此外,通过增加第三级质量筛选形成三级MRM (MRM3 )扫描,也有效提高了选择性[39] 。但是MRM3 面临着同样的问题,额外一级离子筛选降低了检测灵敏度,同时也增加了循环时间。

 

四极杆-高分辨串联质谱技术的发展和扫描速度的提升,为目标蛋白定量提供了新的途径。平行反应监测(Parallel reaction monitoring, PRM)正是相对于传统SRM 建立起来的高分辨离子监测技术[40,41] 。PRM 基于以Q-Orbitrap 为代表四极杆-高分辨质谱平台,与SRM 每次扫描一个Transition 不同,PRM 每次对一个母离子产生的所有Transition 进行全扫描,即平行监测了一个母离子对应的所有离子对。首先,PRM 使用四极杆(Q1)选择母离子,选择窗口通常m / z 臆2; 然后,母离子在碰撞池(Q2)中碎裂,形成子离子; 最后,以Orbitrap 取代Q3,对所有子离子进行高分辨/ 高质量精度(HR/ AM)的全扫描,完成PRM 采集(图4)[42] 。相比传统的SRM,PRM 的优势在于:(1) 高分辨子离子监测,质量精度达ppm 级(通常外标法<3 ppm,内标法<1 ppm),在不损失灵敏度的情况下,最大程度地排除了背景干扰; (2)二级为全扫描,无需事先确定离子对和优化碰撞能量,只需要在数据处理时选择响应最高的一个或几个子离子,即可提取母子离子对的色谱峰进行定量,线性范围可达5 ~ 6 个数量级; (3) 同时定性与定量分析,二级全扫描谱图用于定性分析,选择其中最佳的子离子提取离子对即可完成定量分析。

 

Peterson 等[40] 利用14 条标准肽段比较了SRM和PRM 两种扫描方式的选择性和灵敏度,结果表明在无基质的情况下,SRM 和PRM 的定量限均能达到amol 级; 而在酵母基质中,PRM 的定量限仍保持在amol 级,但SRM 的定量限只有fmol 级,上升了一个数量级(图5A),SRM 离子对受到很大的基质干扰(图5B)。Gallien 等[42] 使用SRM 和PRM 考察了35 条重标肽段的175 对离子对在尿液基质中的最低定量限,结果表明,只有19% 的离子对其SRM 定量限低于PRM 定量限。近来,PRM 逐渐应用到生命科学研究中,Tsuchiya 等[43] 对野生型和UFD4 基因(泛素融合降解通路)敲除型细胞中脯氨酸-茁-半乳糖苷酶(Ub-茁-bgal)的泛素化进行PRM 监测和定量分析,研究两种细胞中泛素链与蛋白连接位点的变化,证明了UFD4 与K29 型连接的泛素化密切相关。Tang 等[44] 利用PRM 验证了组蛋白H3 和H4 的甲基化、乙酰化、丙酰化等55 种修饰位点,并对修饰程度进行了定量分析,还发现了H3 K18 甲基化、H4 K20 乙酰化等诸多全新修饰位点。

 

 

图4选择反应监测SRM(A)与平行反应监测PRM(B)原理[40]

Fig. 4Principle of selected reaction monitoring (SRM)

and parallel reaction monitoring (PRM) [40

 

 

图5SRM/ PRM 灵敏度与选择性比较[40] :(A) 多种肽段在无基质和酵母基质中的定量限比较; (B) 酵母基质

中肽段GVSAFSTWEk 的提取离子流图比较

 

Fig. 5Comparison of sensitivity and selectivity of SRM/ PRM [40] : (A) Comparison of LOQs of peptides in neat and yeast matrix. (B) Comparison of extracted ion chromatograms of peptide GVSAFSTWEk in yeast matrix

 

 

然而PRM 的分析通量不如SRM。PRM 能同时监测最多10 ~15 个母离子,而SRM 能同时监测上百个离子对,因为高分辨质谱的有效扫描速度通常只有10 ~15 Hz,远慢于SRM 的有效扫描速度。但是这一问题正逐步得到解决,多重累积(Multiplexing, MSX)技术的发展和使用有效提高了PRM 的分析通量。多重累积利用Orbitrap 前端的C 型阱(C-trap),不同质量的母离子依次被四极杆选择并储存于C-trap 中,等待Orbitrap 完成上次扫描后,C-trap 中储存的混合离子同时注入到Orbitrap 中进行扫描,实现最多10 个目标物的同时监测,分析通量最高可提升10 倍[45] 。Gallien 等[46] 将多重累积与PRM 结合建立MSX-PRM 技术,利用4 重累积和保留时间分段(1. 5 ~2. 5 min 窗口),在60 min 液相梯度下,定量监测了酵母全蛋白裂解液中770 个目标肽段,对应436 种蛋白。其中,同一保留时间下的肽段数量最高达60 个,在这种情况下,循环时间保持在2 s 以下,分析通量达到SRM 的水平。此外,通过优化分辨率、离子注入时间等参数,目标肽段分析通量还能进一步提高:在MSX 设为8 时,同时监测的肽段数量可达128 个[42,45] 。

 

综上所述,高分辨PRM 和MSX-PRM 技术的出现,解决了传统SRM 技术在定量蛋白质组学方面存在的诸多不足,为复杂样本中目标蛋白的验证和绝对定量提供了有效手段。

 

 

基于数据依赖性采集(Data dependent acquisition, DDA)的鸟枪法(Shotgun)是蛋白质组学的经典策略,也是蛋白质组学相对定量的主要技术手段。DDA 二级采集取决于一级扫描结果,易造成低丰度肽段的丢失,具有一定的随机性,扫描点数也不均匀。而SRM 等目标采集方法不能采集非目标肽段,而且分析通量有限。近年来发展的数据非依赖性采集(Data independent acquisition, DIA)结合了DDA 与SRM 的特点,将整个扫描范围等分为若干窗口,每个窗口依次选择、碎裂,采集窗口内所有母离子的全部子离子信息。DIA 无需指定目标肽段,通量无上限,扫描点数均匀,利用谱图库即可实现定性确证和定量离子筛选,同时数据可以回溯,相比传统DDA 和SRM 具有明显优势[47] 。

 

Venable 等[48] 使用线性离子阱(LTQ),以10 m / z 窗口步长依次选择、碎裂、采集,对15 N 标记的酵母全蛋白样品进行相对定量分析,开创了DIA 应用的先河。结果表明,通过DIA 提取的色谱峰,其信噪比、重现性和定量准确性均明显优于DDA,蛋白定量数量增加了87%。Gillet 等[49] 基于Q-TOF (Trip-leTOF),采用32 个连续的m / z 25 窗口建立SWATH 技术,并证明SWATH 的选择性与SRM 相当。SWATH 的发展使DIA 越来越多地应用于定量蛋白质组学[50 ~52] 。同时,基于Q-Orbitrap (Q Exactive)的DIA 技术,同样使用25 m / z 步长,通过更高的分辨率,使复杂样本定量的选择性进一步提高。此外,诸如MSE、AIF 等质量范围不分段的DIA 方法在蛋白定量中也有所应用,但由于这些方法不进行质量分段选择,而是将所有离子同时碎裂、检测,基质干扰较为严重,难以胜任复杂样本的定量分析[49,53] 。

 

然而,由于扫描速度的限制,基于高分辨质谱的DIA 通常需要以m / z 25 的大窗口步长分段,以确保获得足够的扫描点数进行定量。而m / z 25 的选择窗口仍然会引入较多的干扰离子,影响DIA 的定量分析效果(图6A)[54] 。

 

近来,全新DIA 技术的发展使DIA 的选择窗口不断缩小,DIA 定量选择性、灵敏度和重现性进一步提高。其中,前文提到的多重累积技术已应用到DIA 中,Egertson 等[54] 利用Q-Orbitrap 的多重累积功能发展了MSX-DIA 技术,随机将5 个m / z 4 窗口依次选择、累积,然后同时注入Orbitrap 进行扫描。MSX-DIA 总步长仍然是m / z 20,不影响扫描速度,而m / z 20 由5 段独立的窗口组成,实际选择窗口仅m / z 4(图6A)。数据利用Skyline 软件去卷积,即可将每个碎片归属到特定窗口中,实现m / z 4 窗口的选择性(图6B)。MSX-DIA 的选择性已接近DDA,最大程度减少了共流出肽段和杂质的干扰。Q-OT-qIT 三合一质谱技术的出现为提高DIA 性能带来了更多可能[55] 。利用Q-OT-qIT 中Orbitrap和线性离子阱互不干扰、平行工作的特点,使Orbitrap 专门进行一级扫描,线性离子阱专门进行二级DIA 扫描,线性离子阱扫描速度达20 Hz,比高分辨扫描更快。然后,使用一级超高分辨谱图进行母离子色谱峰的精确提取和定量,二级谱图只用于确证、不用于定量。因此,整体扫描速度明显增加,同时二级DIA 扫描又无需关注扫描点数,为进一步缩小选择窗口带来可能。WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 正是基于这种模式建立的DIA 技术(图7)[56,57] 。WiSIM-DIA 将m / z 200 宽窗口一级选择离子监测扫描(Wide i-solation window-SIM)与m / z 12 窗口步长的二级离子阱全扫描相结合,24 万分辨率的宽窗口SIM 扫描有效提高了母离子的选择性,利用母离子精确质量提取色谱峰进行定量,相比经典DIA 的子离子定量灵敏度更高(图7A)。同时,利用二级谱图实现肽段定性确证。虽然与经典DIA 相比,WiSIM-DIA 二级为低分辨谱图,但选择窗口从m / z 25 缩小到了m / z 12,能有效减少基质背景的干扰。更进一步,Full MS-DIA 以m / z 3 步长进行二级采集,并插入若干24 万分辨率的一级全扫描保证母离子扫描点数,与WiSIM-DIA 一样,利用一级母离子定量、二级子离子定性(图7B)。值得注意的是,Full MS-DIA 将选择窗口缩小到仅m / z 3,其选择性与DDA 相当,数据可以直接作为低分辨谱图(母离子依1. 5 Da 质量精度)进行数据库检索,鉴定结果与DDA 高度吻合,首次使DIA 摆脱了依赖于谱图库的局限,初步实现了DIA与DDA 的统一[57] 。当然,DIA 数据直接进行数据库检索的算法和卡值方法也已出现,很快就会应用到DIA 中,从而使DIA 和DDA 一样可以直接搜库鉴定,彻底摆脱谱图库的限制,已有数据证明DIA 能够获得比DDA 更多的鉴定结果。

 

 

图6DIA 与MSX-DIA 原理[54] :(A) DIA 与MSX-DIA 采集原理与比较; (B) MSX-DIA 谱图通过去卷积归属获得4 m / z 窗口谱图

 

Fig. 6Schematic elucidation of data independent acquisition (DIA) and multiplexing-data independent acquisition (MSX-DIA)[54] : (A) Comparison of DIA and MSX-DIA; (B) Deconvolution of MSX-DIA spectra for 4 m / z selectivity

 

此外,最近发展的pSMART 技术,利用m / z 5 步长进行二级Orbitrap 扫描,并在扫描范围内插入若干一级超高分辨Orbitrap 扫描,在Q-Orbitrap 平台上实现了类似WiSIM-DIA 的采集技术[58] 。结果显示,无论是定性还是定量分析,pSMART 的灵敏度、选择性和重现性都要明显优于传统DIA。

 

无论是相对定量还是绝对定量方法,DIA很好地克服了DDA鸟枪法和SRM目标监测的种种不足, 在定量蛋白质组学中具有良好的应用前景。然而,目前DIA 方法的循环时间仍然较长,只能与纳流液相联用,并使用较长的梯度以获得足够的色谱峰宽,限制了DIA 的应用范围。这也是DIA 技术下一步需要解决的问题。

 

 

图7WiSIM-DIA 与Full MS-DIA 原理[57] :(A) WiSIM-DIA 采集原理; (B) Full MS-DIA 采集原理

Fig. 7Schematic elucidation of wide isolation-SIM (WiSIM)-DIA and Full MS-DIA[57] : (A) Workflow of WiSIM-DIA; (B) Workflow of Full MS-DIA

 

 

基于报告离子定量的同重同位素标记、目标离子监测和数据非依赖采集已成为定量蛋白质组学的主要技术手段,表1 总结和比较了这3 种方法的原理和异同。定量蛋白质组学的飞速发展为质谱技术带来挑战,基于稳定同位素标记的相对定量和基于SRM 的绝对定量都面临着复杂基质的严重干扰和通量不足等局限(表1)。而近来一系列高分辨质谱新技术的发展为解决这些问题带来希望。其中,同步母离子选择和质量亏损标记有效解决了相对定量的干扰和通量问题; 平行反应监测及多重累积技术提高了SRM 的选择性,成为绝对定量的新途径; 数据非依赖性采集兼具DDA 与SRM 的优势,多重累积和三合一质谱技术使DIA 的扫描步长进一步缩小,能更有效地使DIA 技术应用于高通量的定量蛋白质组学。未来,这些新技术将逐渐取代传统质谱技术,越来越多地应用到定量蛋白质组学中,为解决诸如蛋白质相互作用、临床标志物研究等领域最棘手的问题带来新的手段和突破。

 

表1 定量蛋白质组学主要技术的原理与进展

Table 1 Principle and progress of quantitative proteomic methods

 

 

1 Ong S E, Mann M. Nat. Chem. Biol. , 2005, 1(5): 252-262

2 Veenstra T D. J. Chromatogr. B, 2007, 847(1): 3-11

3 ZHOU Yuan, SHAN Yi -Chu, ZHANG Li -Hua, ZHANG Yu -Kui. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(6):496-502

周愿, 单亦初, 张丽华, 张玉奎. 色谱, 2013, 31(6): 496-502

4 Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B. Anal. Bioanal. Chem. , 2007, 389(4): 1017-1031

5 ZHU Jin -Lei, ZHANG Kai, HE Xi -Wen, ZHANG Yu -Kui. Chinese J. Anal. Chem. , 2010, 38(3): 434-441

朱金蕾, 张锴, 何锡文, 张玉奎. 分析化学, 2010, 38(3): 434-441

6 Lange V, Picotti P, Domon B, Aebersold R. Mol. Syst. Biol. , 2008, 4: 222

7 Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Mol. Cell. Proteomics, 2002, 1(5):376-386

8 Capelo J L, Carreira R J, Fernandes L, Lodeiro C, Santos H M, Simal -Gandara J. Talanta, 2010, 80(4): 1476-1486

9 Boersema P J, Raijmakers R, Lemeer S, Mohammed S, Heck A J. Nat. Protoc. , 2009, 4(4): 484-494

10 Koehler C J, Strozynski M, Kozielski F, Treumann A, Thiede B. J. Proteome Res. , 2009, 8(9): 4333-4341

11 Thompson A, Schafer J, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G, Neumann T, Johnstone R, Mohammed A K, Hamon C. Anal. Chem. , 2003, 75(8): 1895-1904

12 Ross PL, Huang Y N, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet -Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Mol. Cell. Proteomics, 2004,3(12): 1154-1169

13 Karp N A, Huber W, Sadowski P G, Charles P D, Hester S V, Lilley K S. Mol. Cell. Proteomics, 2010, 9(9):1885-1897

14 Ow S Y, Salim M, Noirel J, Evans C, Rehman I, Wright P C. J. Proteome Res. , 2009, 8(11): 5347-5355

15 Ting L, Rad R, Gygi S P, Haas W. Nat. Methods, 2011, 8(11): 937-940

16 ZHAO Yan, YING Wan -Tao, QIAN Xiao -Hong. Chem. Life, 2008, 28(2): 210-213

赵焱, 应万涛, 钱小红. 生命的化学, 2008, 28(2): 210-213

17 Sherman J, McKay MJ, Ashman K, Molloy MP. Proteomics, 2009, 9(5): 1120-1123

18 Abbatiello SE, Mani DR, Keshishian H, Carr SA. Clin. Chem. , 2010, 56(2): 291-305

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ZHANG Wei*

(Thermo Fisher Scientific, Shanghai 201206, China)

 

Abstract Mass spectrometry is an important and powerful tool for protein quantification. With the in -depth development of quantitative proteomics, limitations of classic MS based quantification methods, such as complicated matrix interference and throughput/ capacity limitation, start to appear. Recent progress of series novel MS based techniques provide effective solutions for the limitations of relative and absolute proteomic quantification, including synchronous precursor selection ( SPS), mass defect isobaric labeling, parallel reaction monitoring (PRM), multiplexing acquisition (MSX), and various novel data independent acquisition(DIA) modes. Here we summarized the current limitations of quantitative proteomics, reviewed the latest MS based quantification approaches, and discussed the features and advantages of these novel techniques for quantitative proteomic application.

 

Keywords Quantitative proteomics; Synchronous precursor selection; Parallel reaction monitoring; Data independent acquisition; Review

 

(Received 10 September 2014; accepted 18 October 2014)