张伟†, 顾培明†, 江峥*, 明红, 陈伟

赛默飞世尔科技(中国)有限公司, 上海 201206

† 同等贡献

* 联系人, E-mail: zheng。jiang@thermofisher。com

 

关键词 蛋白质组学 快速鉴定 深度覆盖 静电场轨道阱 Q-OT-qIT质谱

 

蛋白质组深度覆盖分析(in-depth proteome)已成为蛋白质组学研究的发展趋势, 通过大规模鉴定和挖掘极低丰度的蛋白, 为信号通路、分子靶点和生物标志物的研究提供重要信息。然而, 由于全蛋白样本的复杂性, 蛋白质组深度鉴定对色谱分离要求很高, 通常需要进行二维分离(强阴离子交换、高pH反相等), 或使用一维长梯度分离, 以降低高丰度蛋白的干扰[1,2]。但这样消耗了大量时间, 重现性也不佳, 成为蛋白质组深度覆盖研究的瓶颈。

 

静电场轨道阱(orbitrap)质量分析器具有超高分辨率、超高灵敏度等特点, 有效推动了蛋白质组学的发展[3,4]。新型Q-OT-qIT(Orbitrap Fusion)质谱系统首 次将四极杆(quadrupole, Q)、静电场轨道阱(orbitrap, OT)和线性离子阱(linear quadrupole ion trap, qIT)3种质量分析器集为一体, 利用动态扫描管理技术, 实现了3种质量分析器同时工作并相互协作, 一级、二级扫描同时进行, 使分析效率达到最大化[5]。Hebert等人[6]利用Q-OT-qIT质谱, 5次重复实验, 在70min有效梯度下鉴定到约4000个酵母蛋白, 同样的结果, 目前的文献报道至少需要4h, 分析效率(单位时间蛋白鉴定数量)提高了4倍以上[7,8]。基于此,Hebert等人[6]首次提出“一小时酵母蛋白质组”的概念, 即1h左右的短梯度实现酵母蛋白质组深度覆盖。蛋白质组学已进入新的时代。

 

本文使用Q-OT-qIT质谱系统对HeLa和酵母细胞全蛋白进行短梯度快速鉴定, 并对基于Q-OT-qIT质谱的“一小时蛋白质组”深入考察与优化。结果显示, 单次实验、50min有效梯度, 分别从1 μg和50 ng HeLa中鉴定到20860和14100条肽段, 对应3865和2877个非冗余蛋白, 分析效率相比目前的报道提高了至少2~3倍[9]。本文还对比和优化了多种扫描组合和参数设置, 为各类实验提供了最合适的采集模式。

 

1.1 样品前处理

分别取适量HeLa和酵母细胞沉淀, 加入含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)和50 mmol/L二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)的蛋白提取液(使用前加入蛋白酶抑制剂), 在超声细胞破碎仪中超声3×5s. 冰上放置20min后, 于4℃离心30min(15000×g)并取上清, Bradford法测定总蛋白浓度.

 

向蛋白提取液中加入DTT, 使终浓度为10 mmol/L, 于56℃振荡30min. 再加入碘乙酰胺(iodoacetamide, IAM), 使终浓度为50 mmol/L, 于室温避光振荡40min. 反应后, 加入6倍体积的预冷丙酮, 20℃放置3h, 再于4℃离心30min (15000×g)弃上清. 按10 μg/μL的浓度将沉淀重溶于50 mmol/LNH4HCO3缓冲溶液, 并加入足量胰蛋白酶(trypsin), 37℃酶解过夜. 酶解后, 将全蛋白酶解液稀释至终浓度为0.5 μg/μL.

 

1.2 纳流液相色谱方法

色谱仪: 纳流速超高效液相色谱EASY-nLC 1000(Thermo, 美国); 色谱柱: 纳流C18EASY-Spray柱(2 μm, 100 Å, 75 μm×25 cm/50 cm), 流速250nL/min; 自制纳流C18柱(3 μm, 100 Å, 75 μm×15 cm), 流速300nL/min; 流动相A: 0.1%甲酸-水溶液;流动相B: 0.1%甲酸-乙腈溶液.

 

50min有效梯度: 0~2min, 3%~5% B; 2~42min, 5%~22% B; 42~52min, 22%~30% B; 52~55min, 30%~90% B; 55~60min, 90% B. 70min有效梯度: 0~5 min, 3%~8% B; 5~60min, 8%~20% B; 60~75min, 20%~30% B; 75~80min, 30%~90% B; 80~90min, 90% B.

 

1.3 质谱方法

质谱仪: Orbitrap Fusion(Q-OT-qIT)高分辨质谱仪(ThermoFisher, 美国); 离子源: EASY-Spray或Nanospray Flex纳升电喷雾源; 喷雾电压: 2.2 kV; 离子传输管温度: 275℃; RF-lens: 60%.

扫描模式: Top-speed; 循环时间: 3 s; 动态排除: 60 s.

一级扫描: 质量分析器,轨道阱; 扫描范围,m/z350~1800; 分辨率,120k; 最大注入时间,50 ms; 自动增益控制(AGC): 2e5.

二级IT扫描: 离子选择,四级杆; 选择窗口,2 amu; 质量分析器,离子阱(ion trap, IT); 扫描速度,Rapid; 最大注入时间,35 ms; AGC: 1e4; 碎裂模式,HCD; 碎裂能量, 35%.

二级OT扫描: 离子选择,四级杆; 选择窗口,2 amu; 质量分析器,轨道阱; 分辨率,15k; 最大注入时间,35 ms; AGC,1e5; 碎裂模式,HCD; 碎裂能量, 35%.

 

1.4 数据分析

数据使用Proteome Discoverer 1.4软件搜库鉴定. 搜索引擎: SEQUEST HT; 数据库: Uniprot人和酵母蛋白数据库; 蛋白酶: 胰蛋白酶(full); 最大漏切位点: 2; 母离子质量精度: 10 ppm; 子离子质量精度: 0.6 Da(qIT)/0.02 Da(OT); 固定修饰: Carbamidomethyl(C+57.021 Da); 可变修饰: acetyl(N-terminus+42.011 Da), deamidated(N, Q+0.984 Da), oxidation(M+15.995 Da). 搜库结果使用Percolator计算q值进行卡值. 同时, 使用Preview软件分析数据质量.

 

2.1 Q-OT-qIT短梯度分析HeLa和酵母蛋白质组

实验对1 μg和50 ng HeLa进行50min有效梯度采集, 对1 μg酵母全蛋白进行70min有效梯度采集, 采用OT-HCD-IT扫描模式, 一级轨道阱、二级离子阱扫描, HCD高能碎裂. 结果显示, 有效出峰时间蛋白酶解产物得到充分分离, 质谱响应良好(图1). 即使在50 ng的极低样本量下, 仍获得良好的分离效果和质谱响应(图1B).

 

1 μg HeLa样本在50min有效梯度内共获得53209张谱图, 平均每秒1.7张一级谱图、16.1张二级谱图, 平均每循环9.6张二级谱图; 酵母样本在70min有效梯度内共获得60295张谱图, 平均每秒1.8张一级谱图、12.5张二级谱图, 平均每循环6.9张二级谱图(表1). HeLa细胞比酵母复杂, 存在更多的蛋白, 因此获得更多的二级谱图. 此外, 在50 ng HeLa的极低样本量下, 总谱图数也达到41099张.

 

图1 HeLa和酵母蛋白酶解产物的LC-MS/MS总离子流图

A: 1 μg HeLa; B: 50 ng HeLa; C: 1 μg酵母

 

 

2.2 HeLa和酵母蛋白质组快速鉴定结果

数据经SEQUEST HT搜库和Percolator卡值, 从1 μg和50 ng HeLa样本中分别鉴定到20860和14100条肽段(q值0.01), 分别对应3865和2877个非冗余蛋白(表2), 而同样的鉴定数量, 目前的报道至少需要2~3h[9]. 另外, 酵母样本共鉴定到15083条肽段(q值0.01), 对应2697个非冗余蛋白(表2).

 

HeLa数据进一步使用Preview软件分析谱图质量精度(图2). 结果显示, 母离子(m/z)质量精度平均为0 ppm, 子离子质量精度(m/z)平均为0.075 Da. 轨道肼质量偏差基本保持在5 ppm以内, 具有高质量精度和长期稳定的质量轴; 离子阱质量偏差基本保持在±0.2 Da以内, 质量精度良好, 保证了数据的质量与结果可信度.

 

肽段ATAGDTHLGGEDFDNR的谱图展示了Q-OT-qIT质谱的碎裂效果和灵敏度(图3), 谱图具有丰富的碎片信息、良好的匹配度和较高的灵敏度. 此外, HCD和CID两种碎裂模式效果相当并有着各自的特点: HCD避免了CID的三分之一效应, 低分子量端信息没有丢失, 同时速度比CID快5%; 而CID灵敏度更高, 对低丰度肽段碎裂效果更明显.

 

2.3 不同碎裂模式和检测方法比较与分析

鉴于不同模式的鉴定效果差异明显, 实验深入考察了HCD/CID碎裂模式和轨道阱/离子阱二级检测方法对鉴定结果的影响. 首先分析了HeLa在OT-HCD-IT, OT-CID-IT和OT-HCD-OT3种模式下的鉴定结果, 比较其互补性. 结果表明, HCD和CID共同鉴定到的肽段占32.7%, 仅一种碎裂模式鉴定到的占67.3%; OT/IT同时检测到的肽段占51.9%, 仅一种质量分析器检测到的占48.1%(图4). CID有三分之一效应, 造成低分子量端的质量歧视, HCD克服了低质量端歧视, 但灵敏度略低于CID; 离子阱具有较高的扫描速度和灵敏度, 而轨道阱的高分辨率与高质量精度有效排除了复杂样本基质的干扰. 因此, 两种碎裂模式和检测方法具有一定的互补性.

 

实验进一步使用OT-HCD-IT, OT-CID-IT, OT-HCD-OT和OT-CID-OT4种扫描模式, 对酵母样本进行60 min有效梯度采集, 详细比较了不同扫描模式的差异. 其中, 二级IT采用Rapid扫描, OT采用30k分辨率. 鉴定结果以OT-HCD-IT结果为100%归一化(图5). 结果表明, 由于OT-HCD-IT速度最快, 获得的谱图数和鉴定结果最多; CID比HCD慢5%, 因此鉴定结果少5%; OT-HCD-OT为两级高分辨, 一级、二级无法同时运行, 谱图数和蛋白鉴定数分别是二级IT扫描的70%和85%; OT-CID-OT速度最慢, 谱图数和蛋白鉴定数分别是OT-HCD-IT的60%和75%. 此外, 4种扫描模式的谱图解析率相差不大, 表明不同扫描模式对数据质量影响不大.

 

2.4 离子最大注入时间与自动增益控制(AGC)对结果的影响

利用C-trap控制离子的注入时间和注入数量(自动增益控制)是轨道阱质量分析器的特点, 进入轨道阱的离子数量对检测结果影响很大, 合适的离子数量不仅避免了空间电荷效应, 还能够明显提升谱图质量、动态线性范围和检测线. 实验在OT-HCD-OT模式下设置不同参数对HeLa样本进行分析(二级OT采用15k分辨率), 进一步探索不同的最大注入时间和AGC设置对结果的影响(表2).

 

鉴定结果表明, 当样本浓度较高(1 μg)时, 离子数量充足, 较小的注入时间和AGC即可获得良好的结果;增加注入时间和AGC反而会降低扫描速度, 减少谱图数量.因此, 参数设置为1.0e5, 35 ms时获得的鉴定数最多(图6A). 当样本浓度很低(50 ng HeLa)时, 需要增加注入时间和AGC以注入更多的离子, 提高灵敏度和谱图质量; 但如果注入时间过长(120和200ms), 谱图数量太少, 也会导致鉴定结果减少.因此, 2.0e5, 60 ms的参数设置获得的鉴定数最多(图6B). 此外, 注入时间越长、离子数量越多, 谱图质量越高, 因此, 离子注入数量与谱图解析率成正比.

 

A: 一级质量精度; B: 二级质量精度

 

 

A: 1 μg样本量, CID碎裂; B: 1 μg样本量, HCD碎裂; C: 50 ng样本量, HCD碎裂

 

A: HCD和CID碎裂模式比较; B: 离子阱和轨道阱二级检测比较

 

以OT-HCD-IT为100%归一化

 

图6 不同的最大离子注入时间和AGC结果比较

A: 1 μg HeLa结果比较; B: 50 ng HeLa结果比较. 以每项最高值为100%

 

3 讨论

随着“一小时酵母蛋白质组”全覆盖的实现, 蛋白质组深度覆盖研究迎来新的时代[6]. 在复杂样本蛋白质组研究中, 传统方法需要进行二维分离、分级的方式简化样本、充分分离, 这样不仅操作费力, 也需消耗大量的时间. 而Q-OT-qIT质谱技术使得在60 min左右一维短梯度下实现复杂样本的深度鉴定成为现实.

 

Q-OT-qIT的三合一结构实现了传统质谱难以实现的并列运行, 即一级、二级扫描同时进行, 离子注入、选择、碎裂、检测同时进行(图7). 动态扫描管理技术自动控制和实时优化仪器运行, 使3种质量分析器相互配合、同时工作, 尽可能减少扫描过程和循环间隙的等待时间. “减一逻辑”将二级扫描与上一次一级扫描相关联, 无需等待本次一级扫描确定母离子及电荷, 提高仪器运行速度和分析效率. 以top 10的数据依赖扫描(DDA)为例, 240k分辨率下, 当一级全扫描完成时, 所有二级扫描也同时完成, 一级、二级互不相关、独立运行(图7). 此外, top-speed模式在固定时间内尽可能多地激发二级扫描, 相比传统Top-N模式能更多地采集低丰度肽段, 也保证了一级扫描点数, 有利于同时定性定量.

 

实验结果表明, 1 μgHeLa样本在50 min有效梯度内采集到53209张谱图, 扫描速度为17.7 Hz, 其中包括120k分辨率的一级轨道阱扫描, 并列运行的工作模式提高了仪器整体运行速度. 在严格卡值(1% FDR)下, 鉴定到20860条非冗余肽和3865个非冗余蛋白, 而最新的文献报道需要至少2~3h才能达到相同结果[9]. 酵母样本虽未达到Hebert等人[6]报道的蛋白鉴定数量, 但上样量更低, 并且未进行重复, 比目前其他仪器的报道结果也有2倍以上的提高[8,9]. 在扫描速度方面, Q-OT-qIT虽然未达到Q-TOF类质谱的极限速度, 但谱图质量更高, 谱图解析率比Q-TOF类质谱高2~3倍[8].

 

1 μgHeLa样本在多次实验中的谱图解析率基本达到60%以上, 在加大离子注入时间和注入数量的情况下甚至达到83.1%(表3), 显示了良好的谱图质量. 全蛋白样本体系复杂, 短梯度下会有共流出肽段和基质杂质的干扰, 大量低丰度肽段的二级响应也很弱, 在这样的情况下, 谱图解析率达到80%以上, 显著高于目前的文献报道[8,9]. 此外, 样本量决定了蛋白鉴定数量, 传统蛋白质组学分析需要微克级的全蛋白, 而本实验尝试将样本量降低到纳克级, 即50 ng上样量, 鉴定结果已达到目前微克级的水平, 为低浓度样本和极低丰度蛋白分析提供可能.

 

Q-OT-qIT的三合一结构使扫描方式灵活多样. C-trap与离子阱之间的多极离子通道使离子可以正反向自由移动, 实现了CID/HCD/ETD3种碎裂模式在MSn任意一级使用, 并任意使用轨道阱或离子阱检测, 产生多种组合的扫描模式. 其中, CID碎裂相比HCD灵敏度略高, 但是速度略慢, 且有三分之一效应, 即低质量端歧视, 而HCD在低分子量段具有丰富的碎片信息; 轨道阱的超高分辨率与质量精度可以最大程度地排除干扰, 而离子阱速度更快, 并且可以和轨道阱同时运行, 提高效率. 可见, 由于机理的不同, 各种扫描模式的效果不同, 具有一定的互补性. Q-OT-qIT控制离子注入时间和注入数量的能力也是保证分析效率和灵敏度的重要因素. 注入时间越长、注入数量越多, 则灵敏度越高、谱图质量越高, 但扫描速度越慢; 相反, 离子注入数量越少, 速度越快, 但低丰度离子损失越大, 灵敏度下降. 可见, 实验目的和样本不同,适合的扫描模式和参数也不同, 因此, 实验进一步考察了扫描模式和离子注入参数对结果的影响.

 

结果表明, 不同碎裂模式和检测方法均具有良好的互补性. 轨道阱和离子阱之间有1/2的鉴定结果不重复, HCD和CID之间有2/3结果不重复, 不同的扫描方法结合可以达到更大的覆盖范围. 另一方面, 线性离子阱相比传统离子阱质量精度更高, 质量偏差稳定保持在0.2 Da以内, 达到中高分辨质谱水平, 因此, OT和IT扫描均具有较高的谱图解析率. 在离子控制方面, 通过提高最大注入时间和最大注入数量, 可以增加离子注入量, 提高低浓度样本和极低丰度蛋白的灵敏度; 而降低离子注入量, 能够加快常规样本的分析速度、增加鉴定数量. 通过几种模式和参数的考察、优化, 为蛋白质组快速分析和深度覆盖研究提供了更多选择.

 

4 结论

本文利用Q-OT-qIT三合一质谱, 对HeLa和酵母全蛋白进行了短梯度快速鉴定: (ⅰ) 50 min有效梯度, 从1 μgHeLa中鉴定到20860条非冗余肽和3865个非冗余蛋白, 时间相比目前的报道缩短了50%~60%; (ⅱ) 50 ng极低样本量, 鉴定到14100条非冗余肽和2877个非冗余蛋白, 谱图解析率超过50%; (ⅲ) 考察了HCD/CID碎裂模式和IT/OT检测方法的异同, 结果显示, 不同方法间互补性良好, 并且均有较高的谱图解析率; (ⅳ) 考察了离子最大注入时间和自动增益控制对结果的影响, 表明提高注入时间和注入数量可以显著提高低浓度样本的检测灵敏度. 综上所述, 基于Q-OT-qIT质谱, 本文实现了短时间内对复杂样本蛋白质组深度覆盖分析, “一小时蛋白质组”时代已经到来.

 

轨道阱一级全扫描的同时, 四极杆依次进行若干母离子选择, 离子阱依次进行若干母离子的二级碎片扫描, 三者同时运行

 

致谢 部分图片素材由赛默飞世尔科技圣何塞工厂提供.

 

 

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ZHANG Wei, GU PeiMing, JIANG Zheng, MING Hong & CHEN Wei

 

 

With the realization of “the one hour yeast proteome”, in-deep proteome under rapid LC-MS/MS gradient is achieved. The current study utilized novel Q-OT-qIT mass spectrometer to analyze and optimize “the one hour proteome”. Within 50 min LC-MS/MS gradient, a total of 20860 and 14100 unique peptides were identified from 1 μg and 50 ng HeLa digest, corresponding to 3865 and 2877 proteins, respectively. Similar result from current reports used at least 2–3 h gradient. The effect of various collision modes, detectors, maximum injection times and automatic gain control settings were further evaluated, and the complementarity between different acquisition methods and scan parameters were described. Moreover, the massive parallelization of Q-OT-qIT was discussed, providing useful information for rapid proteome analysis.

 

 

doi: 10.1360/10.1360/052014-16