杂质分析对于药物的研发至关重要1。在研究过程中，杂质谱信息能帮助药物化学家优化合成路线和避免潜在的有毒杂质。在开发过程中，当大量母体化合物存在时，鉴定和表征痕量杂质至关重要，从而促进了高分辨率、高灵敏度和高扫描速度的HR-MS 仪器和智能化结构鉴定软件的发展。

 

为了展示HR-MS 在杂质分析和结构鉴定方面的能力，本文选用了市售药物奥美拉唑。本研究采用了赛默飞世尔科技的Q Exactive 台式Orbitrap 质谱仪和数据处理软件Mass Frontier 来快速分析和鉴定奥美拉唑中杂质的结构。

 

奥美拉唑（CAS# 73590-58-6）购自Sigma-Aldrich，产品号O104-100MG。

乙腈和水来自Fisher Scientific

乙酸铵购自Sigma-Aldrich，产品号73594-25G-F。

甲酸购自Sigma-Aldrich，产品号33015-500ml。

 

奥美拉唑溶液（0.5 mg/mL）配制在1:1 乙腈/ 水混合溶剂中。

 

色谱分离采用Ultimate3000 UHPLC 系统。

色谱柱：Hypersil GOLD 柱，2.1mm×150mm，粒径3 μm.

柱温：35 ℃，流速：0.5 mL/min，进样体积：8 μL

流动相：A - 水；B - 乙腈；C -100 mM 乙酸铵，用乙酸调节pH 值到5

 

 

梯度洗脱：

 

质谱分析采用 Q Exactive 质谱仪的电喷雾正离子模式。在70,000 和 35,000 分辨率FWHM@m/z 200 下分别采集高分辨全扫描一级质谱数据和数据依赖Top3 二级质谱数据。

 

离子源条件：

离子化模式：正离子ESI

离子源：HESI-II

鞘气流速：45 单位N2

辅助气流速：10 单位N2

喷雾电压（KV）：+3.5

毛细管柱温度（℃）：320

S-lens RF 水平：50.0

加热器温度（℃）：400

 

Q Exactive 方法参数：

AGC 目标（全扫描）：3e6

AGC 目标（MS/MS）：1e5

NCE：30，35% 阶梯变化

扫描范围（全扫描MS）：180 到1200 amu

 

采集得到奥美拉唑的高分辨率全扫描和三个最高强度的数据依赖HCD MS/MS 数据。HRAM 全扫描和MS/MS 数据提供了分子量和碎片信息。HCD（高能量碰撞解离）得到了丰富的MS/MS 碎片和低质量端碎片信息。利用Mass Frontier 软件与这些信息互相配合，我们不仅快速检测出奥美拉唑的主要杂质，而且可靠地测定了相应的元素组成，如图1&2 和表1 所示。

 

图1. 奥美拉唑的质谱总离子流图

 

 

图2. 奥美拉唑的高分辨率准确质量数全扫描和MS/MS 谱图

 

 

图3. Mass Frontier 的FISh 功能鉴定杂质

 

表1. 已识别杂质的准确质量数和元素组成

 

 

采用Mass Frontier 的“ 碎片离子搜索”（FISh） 功能处理HRAM 全扫描和MS/MS 数据， 见图3-a。FISh 能轻易识别出与母体化合物具有相同碎片离子的化合物，见图3-b，并根据碎片推断出可能的杂质结构，见图7。通过搜索Mass Frontier 的HighChem 谱图数据库，Mass Frontier的“Fragment and Mechanism（碎片和机理）”功能可以提供推荐结构的参考文献。每个推荐结构的“Fragment andMechanism”结果对于理解结构来源提供了很好的帮助。将数据结果与“Fragment and Mechanism”进行比较，为推荐结构提供了更多的确认/ 否定标准。

 

Mass Frontier 的另一个重要特色是“碎片结构的注解图谱”，用于碎片的自动预测。三个同分异构体的结构鉴定演示了这个功能，见图4 和5。

 

 

图4. m/z 为376.1331 的杂质的三个同分异构体

 

 

图5-a. RT 8.1 min 的m/z 为376.1331 的杂质的MS/MS 谱图

 

 

图5-b. RT 8.5 min 的m/z 为376.1331 的杂质的MS/MS 谱图

 

 

图5- c. RT 11.2 min 的m/z 为376.1331 的杂质的MS/MS 谱图

 

 

*9’和10’是9 和10 的同分异构体。

图7. 奥美拉唑杂质的推荐结构

 

Q Exactive 台式Orbitrap 系统能实现全扫描和MS/MS 数据的高分辨率准确质量数测定（HRAM），为未知杂质的结构鉴定提供至关重要的分子量和结构信息：HRAM 全扫描准确测定元素组成，而HRAM MS/MS 能准确测定杂质成分。

 

Mass Frontier 碎片离子搜索（FISh） 和“Fragment and Mechanism”功能，通过搜索HighChem 碎片数据库准确鉴定未知物的结构。

 

由Q Exactive HRAM 数据和Mass Frontier 软件组成的工作流程能帮助研究人员在药物研究的早期高效准确地鉴定每批次API 中的杂质。

 

1.FDD Guidance for Industry, Q3A (R2) Impurities in New Drug Substances