刘国强

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

 

巴西蜂胶；液相色谱；质谱；异戍二烯基肉桂酸衍生物

 

建立了同时测定巴西蜂胶中27 种活性化合物的反相高效液相色谱- 离子阱静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-MS）的分析方法。实验结果表明乙醇：水（8：2）比乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1：1）和甲基叔丁基醚：甲醇（9：1）提取出更多的酚酸类成分。通过Orbitrap Elite 获得的多级质谱，从巴西蜂胶中共鉴定出27 个成分，包含11 个黄酮类化合物，15 个酚酸类化合物，和1 个有机酸类化合物。其中异戍二烯基肉桂酸衍生物，为巴西蜂胶中的一类重要的生理活性成分，本实验中鉴别出的阿体匹林C （Artepillin C）和Drupanin 可作为巴西蜂胶质量控制方面的标记物。此分析方法可以用于蜂胶的化学成分的分析和商业上的巴西蜂胶制品的质量鉴定。

 

蜂胶是蜜蜂采集胶源性植物的树脂掺和其上腭腺及蜡腺分泌物，经蜜蜂反复加工涂到蜂巢入口、内壁，以保持巢内相对无菌状态的胶状物质，是一种稀有的、珍贵的蜂产品。蜂胶具有诸多的活性作用，如抗菌 ，抗炎镇痛，降胆固醇，抗肿瘤等 。蜂胶中主要的有效成份是黄酮类化合物和酚酸类化合物，此外还含有脂肪酸、氨基酸、萜烯类化合物、矿物质、维生素、胰蛋白酶等化学成分。

 

巴西蜂胶 （Brazilian Bee Propolis） 是指产于巴西的蜂胶，其外观与成分等与世界其他地区的蜂胶有较大差别。 巴西东南部蜂胶中异戊二烯苯丙类含量丰富，在巴西蜂胶中具有药理活性的是异戊二烯基肉桂酸衍生物，其中四个是带有异戊二烯杂环的苯并吡喃，巴西蜂胶因含有一种“阿特匹林C”的特殊成分，被世界蜂胶业追捧，素有“世界蜂胶看巴西”的说法。

 

随着蜂胶产业的迅速发展，蜂胶被广泛地应用于医药、食品、化妆品等领域，蜂胶中阿魏酸、咖啡酸苯乙酯等主要活性物质的含量多少也直接影响到蜂胶的生理活性。仅用黄酮类化合物的含量来控制蜂胶质量已不能满足要求。因此，对蜂胶的化学成分进行综合全面的分析对建立蜂胶的指纹图谱和评价蜂胶质量具有重要的意义。本文采用高效液相色谱- 离子阱静电场轨道阱高分辨质谱联用技术对来自巴西的蜂胶胶囊样品的化学成分进行了全面的分析，在优化的液质条件下，利用Obitrap Elite 对样品中的各个色谱峰进行了精确分子量测定，并在1 ppm的质量偏差范围内拟合出唯一可能的元素组成，再结合多级质谱的碎片裂解规律和数据库的筛查，从巴西蜂胶中共鉴定出了27 个主要成分。

 

甲醇，乙醇，乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，和乙腈( 色谱纯，德国Merck)，甲酸( 优级纯，Merck)；取巴西蜂胶胶囊样品，研细，称取0.5g 置于具塞锥形瓶中，分别加入乙醇：水（8：2），乙酸乙酯：甲基叔丁基醚，或甲基叔丁基醚：甲醇，超声提取30 分钟，用0.22μm 微孔滤膜滤过后，直接进样分析。

 

仪器： Dionex UltiMate 3000 液相色谱仪

色谱柱：Thermo Scientific Syncronis C18 (150×2.1mm, 5μm)

流动相梯度：A 为水相：0.1% 甲酸水，B 为有机相：乙腈

 

流速0.35 mL/min，进样量：2 μL，检测波长为254 nm，柱温为30℃。

 

仪器：Thermo Elite 双压线性离子阱- 高分辨静电场轨道阱组合型质谱仪

质谱参数：HESI Spray voltage: +3.5KV/-3.0KV; Sheath Gas Pressure: 35arb; Aux Gas Pressure: 10arb; Capillary Temp: 320 ℃ ;

Heater Temp: 300℃ ; Scan mode: Full MS(Resolution 60,000)，and MS2-5(Resolution 17,500，NCE 30); Scan range: m/z 100~1000。

 

 

巴西蜂胶成分复杂，采用等度洗脱很难将蜂胶中的多种组分分离，因此本文采用梯度洗脱方式分离蜂胶组分。在选定的色谱条件下，考察不同提取溶剂对蜂胶中活性成分的提取效率。样品中的化学成分分别用乙醇：水（8 : 2），乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 1），和甲基叔丁基醚：甲醇（9 : 1）进行提取，其所得254nm 检测波长下的色谱图，及在正负离子模式下的总离子流图(TIC) 如图 1 所示。由紫外吸收图可知乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 1）和甲基叔丁基醚：甲醇（9 : 1）提取出的样品成分相似，乙醇：水（8 : 2）在9 min 前多出现了一些色谱峰。

 

由上文可知，蜂胶中的化学成分在乙醇：水（8 : 2）的条件下提取效率较高，图2 为样品在此提取条件下254nm检测波长下的色谱图，及在正负离子模式下的总离子流图(TIC) 如下所示，由图可知样品中化学成分在ESI 负离子模式条件下具有较好响应，正离子模式因受聚乙二醇的干扰，对信号的抑制较大。离子流图中所标示的1-27为蜂胶中所鉴定出的主要成分。

 

 

 

正离子模式下，10 min 前可见响应很强的一系列峰，其中1.97，2.70，3.43，和4.14min 处峰的一级质谱如图3 所示：

 

图3. ESI 正离子模式下1.97，2.70，3.43，和4.14min 处峰的一级质谱图。

 

在正负离子模式下，以C，H，O，和N 在1ppm 偏差范围内，从一级质谱图拟合元素组成，可得[M+H]+ m/z 195.12283，239.14906，283.17523，和327.20157 唯一的元素组成分别为C8H19O5，C10H23O6，C12H27O7，和C14H31O8，此四峰间分子式均相差C2H4O，应为聚乙二醇类化合物。

 

如下图4 所示， 正离子模式下，[M+H]+ m/z 195.12283，239.14906，283.17523，和327.20157 的二级质谱图可见其主要的碎片离子为丢失C2H4O 或H2O 所得的碎片离子。由碎片离子m/z 89.05966 可知此聚乙二醇的端基为羟基。故可知正离子模式下出现的一系列化合物为聚乙二醇HO(CH2CH2O)nH，其为巴西蜂胶胶囊样品中的辅料成分。

 

图4. [M+H]+ m/z 195.12283，239.14906，283.17523，和327.20157 的二级质谱图。

 

成分9，10 和11 的多级质谱如下图5，6，和7 所示，负离子模式下均可见[M-H]－ m/z 515.11859。在负离子模式下，以C，H，O，和N 在1ppm 偏差范围内，从一级质谱图拟合元素组成，可得其分子式均为C25H24O12，三者互为同分异构体。

 

在负离子模式下，成分9，10 和11 [M-H] － m/z 515.11859的二级质谱图可见其主要的碎片离子为丢失咖啡酰基C9H6O3 所得的基峰离子m/z 353.08694；三级质谱图中可见m/z 353.08694 主要的碎片离子为丢失咖啡酰基C9H6O3所得碎片离子m/z 191.05588，丢失奎宁酸C7H10O5 所得碎片离子m/z 179.03482，丢失咖啡酸C9H8O4 所得碎片离子m/z 173.04544。

 

图5. 成分9 在ESI 负离子模式下的多级质谱图。

 

图6. 成分10 在ESI 负离子模式下的多级质谱图。

 

图7. 成分11 在ESI 负离子模式下的多级质谱图。

 

对于成10 而言，三级质谱图含有特征性基峰离子m/z191.05588，对于成分9 和11 来说，特征性碎片离子m/z173.04544 为基峰离子，由碎片离子相对丰度可知成分9，10 和11 分别为4,5- 二咖啡酰奎宁酸4,5-di-O-caffeoyquinic acid；3,5- 二咖啡酰奎宁酸3,5-di-O-caffeoyquinic acid；和3,4-二咖啡酰奎宁酸3,4-di-O-caffeoyquinic acid。

 

利用Obitrap Elite 对样品中的各个色谱峰进行了精确分子量测定，并在1 ppm 的质量偏差范围内拟合出唯一可能的元素组成，再结合多级质谱的碎片裂解规律和数据库的筛查，在巴西蜂胶样品中共鉴定出27 个主要成分，其结构和主要的碎片离子分别如图8 和表1 所示。

 

图8. 巴西蜂胶样品中鉴定出的27 个成分的结构式。

 

表 1. 巴西蜂胶样表品1. 中巴西鉴蜂定胶出样的品中2鉴7 个定出成的分2其7 个主成要分的其主碎要片的离碎子片离和子化和合化物合名物名称。

 

 

 

3.1 Thermo Scientific Orbitrap Elite 质谱仪将双压线性离子阱与高分辨的准确质量数（HR/AM）Orbitrap 检测技术相结合，提供优异性能和出色多功能性。其多级质谱MSn 能力有助于同分异构体的鉴定，如本实验中的4,5- 二咖啡酰奎宁酸，3,5- 二咖啡酰奎宁酸，和3,4- 二咖啡酰奎宁酸而言，可通过三级质谱图中碎片离子相对丰度加以区别。

 

3.2 本实验中乙酸乙酯：甲基叔丁基醚（1 : 1）和甲基叔丁基醚：甲醇（9 : 1）提取出的样品成分相似。乙醇：水（8 : 2）在9 min 前出现了一些酚酸类化合物，其提取效率较高。

 

3.3 在巴西蜂胶胶囊样品中聚乙二醇辅料干扰的情况下，通过Orbitrap Elite 获得的多级质谱，仍从中共鉴定出27个主要成分，包含11 个黄酮类化合物，15 个酚酸类化合物，和1 个有机酸类化合物。本实验中鉴别出的阿体匹林C （Artepillin C） 和Drupanin 可作为巴西蜂胶质量控制方面的标记物。此分析方法可以用于蜂胶的化学成分的分析和商业上巴西蜂胶制品的质量鉴定。