线性离子阱多种解离技术对阿德福韦酯杂质谱的全面鉴定
2017-02-13 来源:本站 点击次数:2814前言
活性药物成分（API）和成品药的杂质分析是药物研发中不可或缺的一环。杂质的化学结构信息在评估毒性、改进合成途径，以及根据目标成药选择最佳剂型至关重要。
为保证药效与消费者的安全，世界各国的监管机构都制定了药物杂质分析的指引，清楚说明基于日服用量、使用时间，和药物靶标的限量标准。
LCMS 已经成为最常用的未知杂质分析技术。为了能在大量母药中识别并表征痕量杂质，具有高灵敏度、高扫描速度，并且能进行多级质谱分析（MSn） 的质谱仪必不可少。
在本研究中，Sigma-Aldrich 所售的研究级阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADP） 被用来作为模型化合物进行API 杂质分析。ADP 是广泛用于慢性乙肝病毒感染的一种抗病毒处方药。本研究中使用的LCMS 系统由Thermo Scientific AccelaTM UHPLC 以及 Velos ProTM 线性离子阱质谱仪构成。碎片信息通过结合应用 CID 与Trap-HCD 解离技术获得。数据处理通过软件Mass FrontierTM 完成。
分析方法
材料与试剂
阿德福韦酯（Adefovir dipivoxil，CAS# 142340-99-6）从Sigma-Aldrich 购得，产品号A9730。
乙腈和水 （Fisher）；乙酸铵（Sigma-Aldrich，产品号73594-25G-F）；甲酸（Sigma-Aldrich，产品号33015-500ml）。
样品制备
ADP 溶液，0.5mg/mL，用1 ml 20 : 80 的乙腈和水混合溶剂溶解0.5mg ADP 获得。
HPLC 方法
HPLC 系统：Thermo Accela 1250 泵，开放式Accela 自动进样器及Accela PDA
色谱柱： Hypersil GOLD C18 2.1×150 mm，3 μM，
Thermo Scientific 产品号 071399
柱温：35 ℃
流速：0.5 ml/ 分钟
进样体积：8 μl
流动相：A – 水，B – 乙腈，C - 100 mM 乙酸铵，用乙酸调至pH 5
梯度洗脱：
质谱方法
质谱仪：配有 HESI-II 离子源的Velos ProTM 线性离子阱离子化条件：电喷雾， 正离子模式
1. 全扫模式 m/z 120-1000 amu/ Top5 dd MS/MS，HCD NCE 35%
2. 全扫模式/ 按母离子列表dd MS2/ TOP 3 ddMS3,CID/ Trap-HCD NCE 20%
a. CID MS2 / CID MS3
b. CID MS2 / HCD MS3
c. HCD MS2 / CID MS3
d. HCD MS2 / HCD MS3
结果与讨论
I. 全扫—Top5 HCD dd MS/MS 与“FISh”
ADP 杂质谱分析流程由两次连续的LCMS实验构成。分析目标是为杂质鉴定和结构解析收集尽可能多的信息。第一个 MS 实验包括全扫描和后续的 Top5 HCD 数据依赖MS/MS 扫描（图1）。 接下来，数据通过MassFrontier 当中的Fragment Ion Search（碎片离子检索，FISh）算法进行处理，这是一个新颖的进行杂质检出及鉴定的方法，主要基于母离子解离模式的比较（图2a，b）。与母药拥有相同碎片的成分会被“FISh”识别出来，见图3。
图1.阿德福韦酯的质谱总离子流图
图2. 用Mass Frontier“FISh”算法检测出杂质成分
标注：FISh 检测到的成分
图3. “FISh”算法检测出的杂质成分的XIC
II.Trap-HCD/CID MS2 和MS3 为未知化合物的结构解析提供丰富的碎片信息
进一步的结构信息通过结合母化合物列表、使用Trap-HCD 和CID 解离组合进行MS2 实验获得。
当归一化的碰撞能量水平相同时，Trap-HCD 比 CID 生成的碎片谱图信息更丰富。Trap-HCD 没有低质量数歧视效应，见图4。CID MSn 能够提供步进的裂解信息，对结构解析非常有价值，见图5，6。
图4. 阿德福韦酯在相同的 25%NCE水平下的CID & HCD MS2 谱图
- 全扫，CID dd MS2（设定母离子列表），然后对前三的MS2碎片离子进行 HCD MS3
- 全扫, CID dd MS2 （设定母离子列表），然后对前三的MS2碎片离子进行 CID MS3
- 全扫, HCD dd MS2 （设定母离子列表），然后对前三的MS2碎片离子进行 CID MS3
- 全扫, HCD dd MS2 （设定母离子列表），然后对前三的MS2碎片离子进行 HCD MS3
图5. 杂质m/z 558.19的CID与HCD谱图比对
图6. 杂质 m/z 388.13的CID和HCD MS2 , MS3谱图
图 7. Sigma-Aldrich所售研究级阿德福韦酯（adefovir dipivoxil）样品中所含杂质的可能结构式
根据丰富的HCD、CID MS2和 MS3 碎片信息（见图7），对鉴定出的杂质化合物进行了结构预测。每个杂质组分的精确质量数和元素组成通过台式Orbitrap Q ExactiveTM 质谱仪的高分辨数据确认。
表1. 杂质组分的精确质量数和元素组成通过Q Exactive 高分辨数据确认
结论
两种解离技术—Trap-HCD 和CID—被用来表征市售研究级阿德福韦酯（adefovir dipivoxil）样品中的十三种低含量杂质。当归一化的碰撞能量水平相同时，Trap-HCD 比CID 生成的碎片谱图信息更丰富。Trap-HCD 不存在低质量歧视效应。另一方面，CID 能够提供逐级裂解信息和MSn 谱图，对于阐明子结构关联非常有价值。本研究的结果证明，结合数据后处理软件使用这两种互补的解离方式能够出色完成杂质鉴定与结构解析，提高了未知杂质分析的速度与可靠性。
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