TSQ Endura LC-MS/MS与TraceFinder软件用于440种农残同时定量的高通量分析

2017-02-15 来源:本站点击次数:4004

一站式流程化农残检测解决方案：TSQ Endura LC-MS/MS 与 TraceFinder 软件用于蔬菜基质中 440 种农残同时定量的高通量分析

1.前言

近些年来，此起彼伏的食品安全事件引起了人们强烈的关注，持续不断地严格加强食品安全监管已经成为全社会最大的共识，这直接刺激了限量标准更严格、体系架构更严谨完备的食品安全标准的诞生与升级。在中国，新版GB2763-2014《食品中农药最大残留限量》国家标准已正式颁布实施，它连同日本的肯定列表制度（positive list system）、欧盟的EU/EC 指令条例No.752/2014 等一道，共同构成了各国严格的食品安全监管法规标准体系。相较于上一版，新国标2763-2014 收录的农残种类与最大残留量指标（MRLs）都有了较大的扩容增项，这无疑对相应的农残检测手段提出了更高更严格的技术要求。时至今日，食品安全领域中的工作常态已然转变为对复杂基质中数百计的多农残项目同时进行高灵敏度、高特异性的高通量检测，这种业态转变需要质谱技术的革新，也需要测试解决方案的完善。

TSQ Endura LC-MS/MS是基于主动离子管控技术（Active Ion Management，AIMTM）开发的全新一代液质联用系统，它通过S-lens射频透镜组、中性粒子挡杆、HyperQuad四极杆、主动离子碰撞池、双模式离散打拿极检测器等集成创新（图1），使得仪器对离子聚焦、传输、隔离、碰撞与检测等离子操控环节得以实现了全新突破，赋予了其领先的灵敏度、高达 500 SRM/s 的扫描速度与出色的稳健性，从而能全面满足复杂基质中多农残高通量检测的各种技术挑战，在食品安全领域中具有广阔的应用空间与使用价值。

本文展示了一种以 TSQ Endura MS 为平台、以 TraceFinderTM软件为流程化驱动引擎的一站式农残检测解决方案，并将其用于菜椒基质中 440 种农残同时定量的高通量检测分析。

图 1. 创新的 TSQ Endura MS 质谱仪硬件构造示意图

1.实验条件

2.1 样品制备

实验使用的农残标样由Ultra Scientific 公司提供（Rhode Island, USA），440 种农残混标乙腈溶液的母液浓度为 2.5 µg/ mL。

菜椒（bell pepper）空白基质由美国California Department of Food and Agriculture 提供，基质由15 g 菜椒匀浆物使用15 mL 乙腈，经QuEChERS 方法提取获得。配置基质加标样时,先取适量基质加入1.5 倍体积超纯水用以改善溶剂效应。再取农残混标，使用乙腈/ 水（v/v, 4/6）逐级稀释，最后将加水后的空白基质与对应浓度点的标样溶液混合，充分涡旋混匀后，得浓度为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5… ~200 pg/µL（ppb）的一系列溶液。由低至高，每个浓度点重复进样三针，用以测试农残在菜椒基质中的最低检测限（LOD）与定量限（LOQ），每个农药的标准曲线在LOQ 到 200 pg/µL浓度区间内绘制。

2.2 色谱分离

反相色谱分离使用Thermo Dionex Ultimate 3000 超高效液相色谱仪完成，配备HPG3400-RS 二元高压梯度泵（35 µL 小体积静态混合器）、WPS-3000TRS 自动进样器与 TCC-3000RS柱温箱,色谱条件见下表。

2.3 质谱检测

质谱检测使用TSQ Endura MS 串联三重四极杆质谱仪的 tSRM 定时选择反应监测功能（timed Selected Reaction Monitor）进行，配备Easy-Max NGTM HESI 加热电喷雾离子源。包括保留时间、SRM 离子对、RF 电压与碰撞能量等在内的 tSRM条件，直接从TraceFinder软件pQuan化学数据库（version 1.0, pesticides Quantitation chemical database）调用（图 2）， TSQ Endura MS 仪器方法编辑为拖拽- 释放式设计，且支持各种方法模板的灵活定制（图 3）。根据农残不同的电离属性，方法中正负电离模式来回切换。依据不同化学属性的农药因色谱行为而造成的峰宽不同，设定 tSRM 时间窗口为 1~5 min。除十三吗啉、丙环唑等少数物质外，其余绝大多数设定为 1 min。Q1 与 Q3 分辨率设定为0.7 FWHM，Q2 碰撞池氩气压力为 1.5 mTorr。tSRM 扫描循环时间（cycle time）为 1.2 s。其余质谱条件见下表。

图 2 农残检测方法 TraceFinder pQuan 化学数据库

图 3 实验使用的质谱 tSRM 仪器方法模板界面

2.4 数据处理

实验使用TraceFinder 3.2 软件进行数据库管理、序列采集、数据处理以及报告模板自定义与输出，其灵活强大的功能可为农残检测的流程化提供一站式服务。尤其，作为面向食品安全常见农残的检测方法数据库，TraceFinder 中 pQuan 数据库包含了完备的农残定量与确证信息，以及保留时间、CAS、基本用途等其他相关信息（图2）。利用pQuan 数据库，实验无需再使用标样进行繁琐的方法优化与开发，而是从数据库中调取相关的条件，直接进行样品测定。如图 4 展示的步骤， TraceFinder 软件使得同时进行数百种农残检测的繁复工作大大清晰地流程化了。

图 4 TraceFinder 软件用于农残检测的流程化工作步骤

3. 结果与讨论 TSQ Endura MS 具有业界领先的 SRM 扫描速度，使用简便的 tSRM 功能，质谱只在给定的时间窗口内进行特定离子对的扫描。一方面，这大大提高了质谱扫描离子驻留时间（dwell time）的利用率；另一方面，也唯有此才使得在短至20 min的快速梯度内同时对数百余种农残进行高灵敏度检测成为可能（图 5）。通过对色谱条件的系统优化，从图 6 散点图与频次图可知，实验实现了对440 种农残良好的色谱分离，它们均匀地分布在 20 min 有效分离时间窗口内，这确保了质谱 tSRM 扫描循环时间可以较为均衡地分配到每个transition 上，改善定量效果。

图 5 上图：菜椒基质中 440 种农残同时检测的总离子流图，下图：440 种农残的提取离子色谱图（10 pg/µL）

图 6（1）农残精确m/z vs. 保留时间散点图，（2）保留时间的频次分布图

TraceFinder 具有丰富强大的数据浏览、编辑与再处理等功能，能为高通量农残检测数据处理提供全方位的功能支持。图 7 为 TraceFinder 数据结果的一种典型界面，这中间 LC-MS/MS 农残分析的各种信息得以高度凝练地图形化展示，统全局于一眼，大大有助于提高实际检测工作中的信息处理效率。同时，这一界面可模板化编辑，具有出色的可扩展性，能满足不同实验室的个性化需求。

图 7 TraceFinder 农残检测数据处理结果的典型界面（Compound View）

实验严格综合考虑峰面积的变异系数 CV % （LOD 浓度点处三次重复进样的 CV% 开始稳定重现地小于 30%，LOQ 浓度点处小于 20%）、色谱峰形与信噪比等三种因素，确定了 TSQ Endura MS 对菜椒基质中 440 种农残进行同时检测的 LOD 与 LOQ 值，结果见表1。根据农药化学属性导致的响应水平不同，LOD在0.005 pg/µL（5 ppt）到 20 pg/µL（20 ppb）之间，LOQ分布在0.01 pg/µL（10 ppt）到 50 pg/µL（50 ppb）范围内，对应的峰面积 CV% 分别为 0.34~29.95% 与 0.43~19.94%。并且，有 430 种农残的标准曲线相关系数大于 0.99，显示 TSQ Endura MS 具有出色的线性。

进一步的统计分析得知，实验中 440 种农残 LOD 与 LOQ 的中位数值（median value）分别为0.05 pg/µL（50 ppt）与 0.1 pg/µL（100 ppt），显示了基于主动离子管控技术研发的 TSQ Endura MS 具有出色的灵敏度性能。同时，值得注意的是，本实验为确保分析的高通量性与大多数农残的检测效果，使用了单一流动相体系进行快速正负电离切换，一定程度上牺牲了适用于负离子模式的农残的检测灵敏度（使用乙酸铵体系，会有很大改善）。但尽管如此，如图 8 所示，对表 1 中的农残 LOD 与 LOQ 值进行频次分析可知，累计分别有438（占总数的 99.5%）与 430 种（占总数的 97.7%）农残的 LOD 与 LOQ 小于 10 pg/µL 这一国标最低 MRL 限值，同时这也是欧盟法规与日本肯定列表制度中的通用标准。本方法实现的 LOQ 全部满足GB2763-2014强制国家标准中的MRLs指标要求。因此， TSQ Endura LC-MS/MS 是食品安全领域中高灵敏度、高特异性与高通量农残检测的优质平台。