李春丽 彭兴

赛默飞世尔科技（中国）有限公司

 

N-亚硝基化合物是一类很强的化学致癌物质，包括亚硝胺和亚硝酰胺两大类物质，通常泛称为亚硝胺。超过300 多种N-亚硝基化合物在一种或多种动物身上显示出具有致癌作用[1]，并且40 多种动物包括灵长类都是易于感染N-亚硝基化合物而引起癌症，而且这类强致癌物质在实验动物体上诱导出的肿瘤在形态学特点与生化特点上都与相应的人体器官上发现的肿瘤相似[2]。美国环境保护局（USEPA）认为N-亚硝基二甲胺（NDMA）在极低的浓度（0.7 ng/L）下就会致癌，已将其列为优先控制污染物[3]。许多国家及国际组织都对相应制品中N-亚硝基胺的检测制定了严格的标准[4][5][6]，如中国出台了GB28482-2012 《婴幼儿安抚奶嘴安全要求》；欧盟《玩具安全新指令》（2009/48/EC）中，对其中的N-亚硝基胺含量及迁移量有着极为严格的规定。同时，与该指令配套的欧盟协调标准EN71-12 要求至少检测13 种N-亚硝基胺，包括脂肪族亚硝胺、脂环族亚硝胺及芳香族亚硝胺等。

 

因此开发出快速、灵敏和准确的N-亚硝胺化合物的测定方法，对卫生检测、削减和控制亚硝胺含量的研究是迫切需要的。使用GC-MS/MS 检测N-亚硝胺，已有一定程度的应用[7][8]。赛默飞世尔科技的串接气质联用TSQ 8000 Evo 具有高灵敏度、背景干扰小、稳定性高等特点。本文以TSQ 8000 Evo 为平台建立了橡胶及弹性体材料中11 种N-亚硝基胺GC-MS/MS 检测方法，结合赛默飞世尔科技特有的TraceFinder 软件系统进行数据采集、数据分析和报告输出，实现了数据的快速采集及数据结果的智能处理。为N-亚硝基胺的痕量检测提供了强而有力的技术支持。

 

质谱仪：TSQ 8000 Evo 质谱仪（赛默飞世尔科技，美国）；

气相色谱仪：Trace 1310 气相色谱配AI 1310 自动进样器（赛

默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：TR-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛细管色谱柱；

试剂：正己烷，丙酮，甲醇；均为色谱级

 

1.2.1 气相方法

程序升温：程序升温：35℃（维持 3 min），10℃ /min 到

100℃（维持 1 min），25℃ /min 到 250℃（维

持 3 min）

进样口温度：SSL 分流不分流（220℃）with Splitless 不分流模式

载气流速：1.0 mL/min（恒流）

传输线温度： 250℃

进样体积：1.0 μL

 

1.2.2 质谱方法

质谱运行时间：19 min

扫描方式：Timed-SRM

碰撞气压力：1.0 m Torr 氩气

SRM 条件见下表：

 

11 种N-亚硝基胺化合物及1 种内标物质质谱信息

 

样品制备成2 mm×2 mm×2 mm 大小（均匀取样）。

 

1.4.1 样品提取

准确称取5.00 g（精确到0.01 g）样品于40 mL 棕色玻璃瓶中，加入30 mL 甲醇，于室温超声萃取30 min ，过滤转移溶液至250 mL 平底烧瓶中；再向样品中加入20 mL甲醇溶剂，重复超声和转移步骤，并用少量甲醇洗涤棕色瓶2-3 次，合并两次超声和洗涤溶液；将溶液旋转蒸发（35℃ , 150 mbar）至4 mL 左右，于涡旋混匀器上充分旋转振荡1 min，样品溶液转移至10 mL 具塞离心管中。另取1mL 甲醇分2-3 次洗涤平底烧瓶壁，并于涡旋混匀器上充分旋转振荡1 min，合并洗涤液于10 mL 具塞离心管中。

 

1.4.2 净化

将C18 固相萃取小柱置于固相萃取装置上，用5 mL 甲醇预淋洗C18 小柱。将样液注入小柱，流出液收集于离心管中，待样液液面下降至小柱填料的上层面时，再加入5 mL 甲醇进行洗脱，收集合并全部流出液于离心管中。

 

1.4.3 浓缩

样液于250 mL 的平底烧瓶中，并用少量甲醇淋洗离心管壁2-3 次，合并洗涤液于平底烧瓶中，将溶液旋转蒸发（35℃ , 150 mbar）至4 mL 左右，取下平底烧瓶，于涡旋混匀器上充分旋转振荡1 min，然后将平底烧瓶中的样液转移溶液至5 mL 棕色容量瓶中。用少量甲醇淋洗平底烧瓶2- 3 次，并于涡旋混匀器上充分旋转振荡1 min，合并洗涤液于棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。经0.45 μm滤膜过滤后进行分析。

 

 

使用TSQ 8000 系列产品特有的软件平台TraceFinder，不仅可以实现数据快速、批量、自动化采集及处理，还可完成实验室常用数据报告的自动生成，将Database 数据库，Master method 主方法，Instrument method 仪器方法以及AutoSRM 质谱条件自动优化软件之间有机结合。工作流程如图1 所示。

 

图1. TraceFinder 工作流程

 

对于大部分常见化合物方法信息，已包含在TraceFinder内置数据库中。检测所涉及的化合物的质谱方法信息可使用TraceFinder 通过Database 进行查询、编辑、提取并可直接导入仪器方法中使用。这些化合物包括农药、多环芳烃、多氯联苯、多溴联苯和多溴联苯醚、邻苯二甲酸酯等常见关注化合物。

 

对于11 种N-亚硝基化合物及1 种内标物质，在方法建立初期，其色谱质谱条件未知，需要对其相应的色谱、质谱方法优化。同样可以利用TSQ 8000 系列产品所特有的AutoSRM 软件进行自动优化，可实现优化后自动生成仪器方法的功能。

 

AutoSRM 程序自动进行以下三个步骤：1. 全扫描分析。通常最强的离子将被作为母离子。2. 对母离子进行子离子全扫。信号最强的子离子。 3. 对选定的母离子/ 子离子对进行碰撞能的优化。其工作流程如图2 所示。

 

 

 

实验采用的TR-5MS 色谱柱对N-亚硝胺化合物有良好的分离效果，12 种化合物（含1 种内标物质）在19 min 的分离时间内得到了良好的色谱图，结果如图3 所示。

图3. 12 种化合物色谱图

 

选取4 种物质（NDPA，NDEA，NDBA，NMphA）配置成混合标准品，考察前处理方法的准确性及回收率。根据欧盟农残方法准则要求，回收率需在70-120% 之间。实验以100 μg/kg 浓度水平进行添加回收实验，测定两组平行样品，结果如表1 所示。结果表明，回收率均处于70-120% 之间，方法准确性良好。

 

同时对仪器的稳定性进行了考察，将4 种化合物配置成5.0 μg/kg 标样，连续进样6 次，得到相对应的每个目标化合物物的相对标准偏差（RSD），测试仪器的稳定性，如表1 所示。4 种化合物RSD 均小于5.0%。结果表明：仪器在低浓度水平（≤ 5 μg/kg）连续进样时，仪器稳定性良好，满足痕量检测需求。

 

表1 回收率实验结果

 

TraceFinder 软件可同时实现数据采集及数据处理，根据预先设定的定性离子及定量离子，对化合物的检出结果进行快速、自动化处理，同时实现定性及定量功能。图4为NDPA 质谱图信息。

 

按照上述前处理方法对实验样品进行处理，以空白样品基质制备浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、20、50 μg/kg的基质标准曲线，在确定的色谱和质谱条件下进行测定，对测定结果进行分析，研究方法的灵敏度及检出限。同时选取了两种市售产品（婴儿奶嘴及玩具气球），对其中11 种N-亚硝胺化合物进行了测定。

 

TSQ 8000 Evo 具有灵敏度高和抗干扰能力强的特点，所检测11 种化合物在较低的浓度水平得到了良好的检出效果，完全满足法规要求，如表2 所示。同时，在两种实际样品中均检出了少量的NDBA 残留。结果如表3 所示。

 

实验结果表明TSQ 8000 Evo 在检测含有痕量亚硝胺样品时，具有高选择性、高灵敏度、高稳定性和高通量，在有害化合物检出方面具有优异的表现。同时，强大的TraceFinder 软件集数据采集、处理，方法开发于一体。在简化实验操作步骤的同时，实现了对数据处理的自动化。TraceFinder 自带的AutoSRM 软件，对于未知信息化合物的质谱条件的优化开发，提供了可靠的支撑。

 

 

图4. NDPA 质谱图信息（2 μg/kg）

 

表2.《EN 71-12:2013》中设定的安全要求

 

表3. 灵敏度、检出限及实际样品测定结果

 

[1] R. Preussmann. Carcinogenic N-nitroso compounds and their environmental significance. [M]

[2] Bogovski P．Bogovski S．Animal species in which N-nitroso compounds induce cancer[J]. International Journal of Cancer,1981，24：471-474．

[3] U.S. Environmental Protection Agency. N-Nitrosodimethylamine (CASRN 62-75-9). http://www.epa.gov/iris/subst/0045.htm

[4] GB 28482-2012 《婴幼儿安抚奶嘴安全要求》

[5] 欧盟《玩具安全新指令》（2009/48/EC）

[6] EN 71-12:2013 亚硝胺与亚硝胺化合物》

[7] 童玉贵, 林伟, 林中等. 气质联用法测定鞋类橡胶材料中的N- 亚硝基胺含量[J]. 皮革科学与工程. 2011, 5 (21):56-60.

[8] 李丕, 白桦, 李海玉等. 固相萃取－气相色谱－串联质谱法测定乳胶儿童用品中15 种N- 亚硝胺及其前体物的迁移量[J]. 色谱. 2014,1 (32): 81-88.