DNA甲基转移酶3A活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）活性酶连续循环比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成人工合成甲基受体底物分子和抑制复合物，通过DNA甲基转移酶、腺苷同型半胱氨酸核苷酶、腺嘌呤脱氨酶和黄嘌呤氧化酶反应系统中生成过氧化氢，使用显色染料和过氧化酶后，产生醌亚胺产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞或组织裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解悬液样品（动物、人体等）DNA甲基转移酶3A的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

生物分子的甲基化在各种生物体系统里，诸如信号传导、生物合成、蛋白修复、基因沉默和染色质调节等，发挥着重要作用。将甲基基团加入到CpG二核苷酸上的5’位的胞嘧啶（cytosine）上，成为5’甲基胞嘧啶（5’-methylcytosine），是哺乳动物细胞的一种重要的表观遗传修饰，与胚胎发育、肿瘤发生和遗传疾病有关。DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase；DNMT）催化这一甲基修饰的维持和发生。DNA甲基转移酶分为三种：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1作用于维持甲基化状态，而DNMT3在于建立新的甲基化（de novo methylation）。基于普鲁卡因胺（procainamide），一种非核苷酸类抑制剂，特异性抑制DNA甲基转移酶1活性，以及曲古霉素A（trichostatin A；TSA），一种抗真菌类抗生素，特异性抑制DNA甲基转移酶3B活性的特征，参与其反应体系，即S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine；SAM），又称为AdoMet，作为最常用的甲基直接供给体，通过DNA甲基转移酶把甲基基团转移到人工合成甲基受体底物分子poly[d（I-C） d（I-C）]上，而生成S腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine；AdoHcy），进而快速被腺苷同型半胱氨酸核苷酶（AdoHcy nucleosidase）分解为S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine）和腺嘌呤（adenine），避免了前者累积后负反馈抑制甲基化过程。腺嘌呤由腺嘌呤脱氨酶（Adenine deaminase）产生次黄嘌呤，通过黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）催化，生成过氧化氢，然后借助过氧化酶（peroxidase）的作用，与对羟基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反应，形成有色醌亚胺（quinoneimine），通过其吸收峰值的变化（510nm波长），来定量分析DNA甲基转移酶3A的活性。DNA甲基转移酶3A反应系统为：

DNA methyltransferase 3A

poly[d（I-C） d（I-C）] + AdoMet  →  methyl poly[d（I-C） d（I-C）]  + S-adenosylhomocysteine

                                AdoHcy nucleosidase

S-adenosylhomocysteine    →   adenine  +  S-ribosylhomocysteine

Adenine deaminase

adenine  → hypoxanthine

xanthine oxidase

hypoxanthine  +  2H2O  +  O2  →   urate  +  2H2O2 

                            peroxidase

 2H2O2  +  p-hydroxybenzoic acid  +  4-aminoantipyrine  →   quinoneimine  +  4H2O

产品内容

缓冲液（Reagent A）   3毫升

底物液（Reagent B）      250微升

反应液（Reagent C）      250微升

阴性液（Reagent D）   250微升

专性液（Reagent E） 250微升

产品说明书      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent B）避免光照；有效保证6月

用户自备

100微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长510nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（Reagent B）避免光照；缓冲液（Reagent A）置于室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取90微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升专性液（Reagent E）
• 加入10微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升反应液（Reagent C）
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入5微升阴性液（Reagent D） 
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（15分钟读数－0分钟读数）

• 样品活性测定

• 移取90微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升专性液（Reagent E）
• 加入10微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升反应液（Reagent C）
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入5微升待测样品（20微克核蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（15分钟读数－0分钟读数） 

四、计算样品活性 

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.125（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.58（毫摩尔吸光系数）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔S-腺苷甲硫氨酸 /分钟

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取90微升缓冲液（Reagent A）到96孔板里
• 分别加入10微升专性液（Reagent E） 
• 分别加入10微升底物液（Reagent B）
• 分别加入10微升反应液（Reagent C）
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 分别加入5微升阴性液（Reagent D）或待测样品（20微克核蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数
• 活性计算：

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.125（毫升，测定容量）]÷[0.005（样品容量，毫升）X 6.58（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔S-腺苷甲硫氨酸/分钟

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 建议使用纯化细胞核裂解悬液（20微克核蛋白）作为待测样品
• 样品中避免使用DTT、巯基乙醇、TCEP、EDTA等
• 样品须澄清，至关重要
• 加样后3秒内比色测定
• 测定值由低到高变化；测定可持续15分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 样本测定15分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为20微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• DNA甲基转移酶3A单位活性定义为：在37℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够转移1微摩尔S-腺苷甲硫氨酸甲基所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列甲基化检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感