植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase说明书
2019-07-15 来源:本站 点击次数:735
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase说明书
● 产品简介：
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的关键酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸，在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。此酶是变构酶，主要功能为三羧酸循环提供草酰乙酸， 另外也与 C4 植物光合二氧化碳固定反应及景天科植物的苹果酸形成 (景天酸代谢 )等有关。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)检测试剂盒检测原理如下：在弱碱条件下，PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA)；OAA 在苹果酸脱氢酶(MDH)催化下被 NADH 还原为苹果酸 (Mal) 。在碱性条件下每吸收 1 分子 CO2伴随 1 分子 NADH 氧化，通过分光光度计测定处吸光度的变化，计算出 NADH 的消耗速率，进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。
该试剂盒主要用于检测植物样本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
按照一次使用1 ml 提取缓冲液计算，试剂盒可以使用100次。
● 自备材料：
植物材料；剪刀；液氮；研钵或其他研磨设备；1ml石英比色皿；紫外分光光度计；制冰机；低温离心机
● 操作步骤：
一、 即用型PEPCase提取缓冲液配制：
注：1. 即用型PEPCase提取缓冲液尽量现配现用，短期4℃中可以过夜保存。
二、 PEPCase样品提取：
1. 取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm2叶片（1分硬币大小）或0.1g叶片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取缓冲液，颠倒混匀，冰浴放置5-10分钟。
2.12000g4℃离心 5分钟，上清即为PEPCase提取液，冰浴放置备用。
注：提取液最好立即测定，不建议保存。
三、PEPCase活性测定分析：
1. 即用型酶溶解缓冲液配制：
按照标签所示，在试剂6-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液，冰浴备用，-20℃保存。
2. 试剂3-PEP：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
3. 试剂4-NADH：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：NADH稳定性较差，用后-20℃贮存3-4天，长期-80℃保存。
4. 试剂5-MDH：按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，彻底混匀后冰浴备用。
5. 反应体系设定：
5. 反应体系测定；
1.5 ml离心管中配制以下反应
注意： = 1 \* GB3 ① 一般分光光度计OD340读数在0.5-3之间数据比较准确，低于此范围说明提取用的材料太少，酶活性太低；高于此范围说明所用材料太多，酶活性太高，此时可以将PEPCase样品提取液用即用型PEPCase提取缓冲液稀释后测定。
= 2 \* GB3 ② 该反应系统是利用速率变化，求得相应 OD 的变化，进而推算出 NADH 的消耗速率，再进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase样品提取液后立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。
四、PEPCase活性计算：
根据如下公式计算样品中PEPCase活性：
1. 根据叶片面积的计算公式：
Activity（μmol·m-2·S-1）=
=
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值，△A=A0-A1
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1 △t-秒 测定时间，本程序为60秒 S-cm2 提取时使用的叶面积
2. 根据叶片鲜重的计算公式：
Activity（μmol·g-1·S-1）=
=
Activity（μmol·g-1·S-1）-表示每秒每克鲜重叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值，△A=A0-A1
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1
△t-秒 测定时间，本程序为60秒
g- 提取时使用的叶片鲜重
| 组分货号 | 名称 | 规格 | 贮存 | 运输 |
| RTU4062-01 | 试剂1-PEPCase提取缓冲液（2×） | 100 ml | 短期4℃，长期-20℃ | 常温 |
| RTU4062-02 | 试剂2-PEPCase Assay buffer(10×) | 15 ml | 短期4℃，长期-20℃ | 常温 |
| RTU4062-03 | 试剂3-PEP（100×） | 1 ml | -20℃ | 常温 |
| RTU4062-04 | 试剂4-NADH（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常温 |
| RTU4062-05 | 试剂5-MDH（100×） | 2 KU | -20℃ | 常温 |
| RTU4062-06 | 试剂6-酶溶解缓冲液 | 5 ml | -20℃ | 常温 |
| BSA-02 | 试剂7-BSA溶液 50mg/ml | 5 ml | -20℃ | 常温 |
| DT0140P | 试剂8-1MDTT（100×） | 1 ml | -20℃ | 常温 |
| DE005 | 试剂9-灭菌水 | 100 ml | 4℃ | 常温 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的关键酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸，在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。此酶是变构酶，主要功能为三羧酸循环提供草酰乙酸， 另外也与 C4 植物光合二氧化碳固定反应及景天科植物的苹果酸形成 (景天酸代谢 )等有关。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)检测试剂盒检测原理如下：在弱碱条件下，PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA)；OAA 在苹果酸脱氢酶(MDH)催化下被 NADH 还原为苹果酸 (Mal) 。在碱性条件下每吸收 1 分子 CO2伴随 1 分子 NADH 氧化，通过分光光度计测定处吸光度的变化，计算出 NADH 的消耗速率，进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。
该试剂盒主要用于检测植物样本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
按照一次使用1 ml 提取缓冲液计算，试剂盒可以使用100次。
● 自备材料：
植物材料；剪刀；液氮；研钵或其他研磨设备；1ml石英比色皿；紫外分光光度计；制冰机；低温离心机
● 操作步骤：
一、 即用型PEPCase提取缓冲液配制：
| 一个反应配制体积 | n个反应配制体积 | |
| 1 ml | n×1 ml | |
| PEPCase提取缓冲液（2×） | 500 μl | n×500μl |
| 灭菌水 | 470 μl | n×470 μl |
| 1 M DTT（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| BSA溶液50mg/ml | 20 μl | n×20μl |
二、 PEPCase样品提取：
1. 取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm2叶片（1分硬币大小）或0.1g叶片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取缓冲液，颠倒混匀，冰浴放置5-10分钟。
2.12000g4℃离心 5分钟，上清即为PEPCase提取液，冰浴放置备用。
注：提取液最好立即测定，不建议保存。
三、PEPCase活性测定分析：
1. 即用型酶溶解缓冲液配制：
按照标签所示，在试剂6-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液，冰浴备用，-20℃保存。
2. 试剂3-PEP：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
3. 试剂4-NADH：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：NADH稳定性较差，用后-20℃贮存3-4天，长期-80℃保存。
4. 试剂5-MDH：按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，彻底混匀后冰浴备用。
5. 反应体系设定：
| 加入顺序 | 组份 | 1ml反应体系加入量 （测定1个样品） |
MasterMix配制 （测定n个样品为例） |
| 1 | 10×PEPCase Assay Buffer | 100 μl | n×100 μl |
| 2 | 灭菌水 | 870 μl | n×870 μl |
| 3 | NADH溶液（100×） | 10 μl | n×10μl |
| 4 | PEP溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 5 | MDH溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
1.5 ml离心管中配制以下反应
| 1 | 2 | |
| 对照反应 | 样品活性测定 | |
| MasterMix | 975 μl | 975 μl |
| 即用型PEPCase提取缓冲液（步骤一） | 25 μl | - |
| PEPCase样品提取液 （步骤二） |
- | 25μl |
| 混匀后加入到1 ml比色皿中，立即计时，此时吸光度为A0，每隔 10s 测定一次吸光度，其中至 1min 时处吸光度记为A1，记录其变化。 |
= 2 \* GB3 ② 该反应系统是利用速率变化，求得相应 OD 的变化，进而推算出 NADH 的消耗速率，再进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase样品提取液后立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。
四、PEPCase活性计算：
根据如下公式计算样品中PEPCase活性：
1. 根据叶片面积的计算公式：
Activity（μmol·m-2·S-1）=
=Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值，△A=A0-A1
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1 △t-秒 测定时间，本程序为60秒 S-cm2 提取时使用的叶面积
2. 根据叶片鲜重的计算公式：
Activity（μmol·g-1·S-1）=
=Activity（μmol·g-1·S-1）-表示每秒每克鲜重叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值，△A=A0-A1
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1
△t-秒 测定时间，本程序为60秒
g- 提取时使用的叶片鲜重
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