用细胞爬进行RNA FISH检测的实验操作
2020-02-27 来源:本站 点击次数:1149用细胞爬片进行 RNA FISH 检测的实验流程
1. 细胞在盖玻片上进行培养，细胞长好后用 CSK 缓冲液简单洗涤。
2. 细胞爬片用 4% 多聚甲醛在 4℃ 固定 10 min。
3. 用含有 0.5% TritonX-100,，10 mM VRC 的 CSKBuffer 溶液在 4℃ 处理 10-12 min。
4. 用 70% 酒精，4℃，孵育 10 min。
5. 在-20℃, 分别用 70%，85% 和 100% 的酒精处理 5 min，进行脱水，最后风干。
然后用中性树胶将细胞爬片粘在载玻片上 （正面朝上）。
6. 探针的准备，将加了探针的杂交缓冲液置于 76℃ 变性处理 10 min。
7. 将 5ul 杂交混合液滴在爬片上，盖上盖玻片，经 Rubber Cement 橡胶封片，置于潮湿暗盒中 37 ℃ 杂交过夜。
8. 杂交后，去除橡胶和盖玻片，爬片用 50% 甲酰胺 (2XSSC 配) 在 42℃，洗 5 minX3，然后用 2XSSC 在42℃，洗 5 minX3。
9.DAPI 复染，取适量 DAPI 储存液用 PBS 稀释至 1ug/ml 的工作液，吸 5μL 滴爬片上，盖上盖玻片，黑暗室温孵育 5min。去掉盖玻片，在 PBS 中洗涤 2 次。去掉过量液体，滴加 antifade reagent 封片。
1. 37℃，用合适的含有 FCS，抗生素和其他必要成分的培养基培养细胞。
2. 收集有丝分裂细胞前 10~16 小时在培养基中以 0.06 μg/ml 的浓度加入秋水仙胺。
收获细胞并在聚胺缓冲液中裂解
3. 收获细胞。
对于悬浮培养细胞（500 ml 培养基），室温 1500 g 离心 5 分钟收获细胞。在室温用聚胺缓冲液清洗三次所得到的沉淀，1500 g 离心 5 分钟收集细胞。
聚胺缓冲液：
15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
0.2 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 精咪
2 mmol/L EDTA
80 mmoI/L KCl
0.1 mmol/L PMSF（临用前从用 100% 乙醇制备的 1 mmol/L 的贮存液中加入）
4. 细胞用 20 ml 冰冷的含 0.1％ 毛地黄皂苷的聚胺缓冲液重悬浮。
5. 用 Dounce 匀浆器和 B 研棒进行 10 次温和匀浆裂解细胞（过于剧烈的匀浆会导致染色体明显损伤）。另外也可以将悬液温和地吸到一塑料注射器中，然后推动便其通过 25 号针头（应避免溶液起泡沫）。
6. 细胞裂解后，取出少量裂解液观察染色质释放情况。在有一滴用来进行 DNA 染色的 2 μg/ml Hoechst 33258 的分离缓冲液溶液的载玻片上，滴一滴裂解悬液。用荧光显微镜观察染色质。
7. 用 JS-13 ( Beckman)，HB-4 (Sorvall)，2150 (Herace) 或相似的悬桶式转头在 250 g 离心 1 分钟沉淀裂解液去除碎片。
8. 取出含有染色体的上清，3000 g 离心 15 分钟。
9. 将含有染色体的沉淀重悬浮于 5~10 ml 的聚胺缓冲液中。制备的染色体可以在 4℃ 保存。保存 2~4 个星期后观察不到形态的变化；但对于特殊目的的研究（例如酶活性，不稳定蛋白），得到的染色体应立即使用。
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