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PCR法检测新冠等病毒DNA/RNA的荧光探针

2020-04-27     来源:本站     点击次数:521

今天，百萤为大家介绍使用PCR来对病毒DNA/RNA进行标记、定量、检测的荧光探针。在临床分子诊断中，核酸扩增检测法，例如“逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）”可以用来早期检测和鉴定由逆转录病毒引起的传染病。RT-PCR以mRNA为起始模板，可在体外快速转录、扩增和检测逆转录病毒的遗传物质。核酸检测已成功用于检测大多数逆转录病毒，包括流感病毒，肠病毒，冠状病毒，埃博拉病毒和HIV。

逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）

逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是检测和定量mRNA表达水平的高度灵敏技术。在RT-PCR中，使用逆转录酶将RNA模板逆转录为互补DNA（cDNA）。然后使用标准PCR程序（变性，退火和延伸）将cDNA用作扩增模板。RT-PCR可用于多种应用，包括基因表达分析，微阵列，病原体检测和疾病研究。

表1.RNA定量试剂/试剂盒

产品名称 Ex（nm） Em（nm） 规格 货号
StrandBrite 绿色荧光RNA定量试剂盒*高选择性* 490nm 540nm 100 Tests 17657
StrandBrite 绿色RNA定量试剂 490nm 525nm 1ml 17610
10ml 17611
Portelite 荧光RNA定量试剂盒 490nm 525nm 100 Tests 17658
500 Tests 17659

RT-PCR定量方法及产品

RT-PCR产物的定量方法通常可分为两类：终点RT-PCR和实时PCR。终点RT-PCR常用来测量少量样品中的基因表达变化，而实时RT-PCR已成为在全球范围内验证基因表达变化的标准方法。

 

1.终点RT-PCR

终点RT-PCR是在完成最后一个PCR循环后对PCR产物进行的分析。 用于定量终点RT-PCR的通用测量方法要求通过使用荧光染料（例如溴化乙锭EB）或P32标记的PCR产物的定量来检测基因表达水平。 终点RT-PCR可用于通过三种不同方法测量表达水平的变化：相对，竞争和比较。

表2.终点RT-PCR检测方法

终点RT-PCR 特点
相对RT-PCR
  • 利用引物进行内部对照，并与基因特异性引物多路复用
  • 需要兼容的内部对照和基因特异性引物
  • 可以比较多个样本之间的相对转录本丰度
  • 结果用基因信号与内控信号的比值表示，可用于样本间比较，以估计相对靶RNA的表达
竞争性RT-PCR
  • 用于绝对定量样品中特定mRNA的技术。
  • 将合成RNA和竞争RNA添加到样品RNA复制物中，并与内源性靶标共同扩增
  • 产生竞争RNA的浓度曲线，并将其用于比较内源转录本产生的RT-PCR信号，以确定样品中存在的靶标量
比较RT-PCR
  • 类似于竞争性RT-PCR，在一个单一反应中，靶RNA与一个不相关序列的内标竞争扩增试剂
  • 将结果与外标曲线比较，以确定目标RNA浓度
  • 这三种方法更方便，因为它不需要预先确定mRNA（相对RT-PCR）或合成竞争性RNA（竞争性RT-PCR）

 

2.实时RT-PCR

实时PCR（RT-PCR）使用荧光报告分子来可靠地检测在PCR过程的每个循环中生成的产物。（随着反应的进行，由于每个扩增循环中PCR产物的积累，荧光增加。）。这些荧光报告分子包括结合到双链DNA的染料（例如Cyber​​ Green ）或序列特异性探针（例如Molecular Beacons）。

2.1使用DNA结合染料的非特异性检测

在实时PCR中，DNA结合染料被用作荧光报告基因，以实时检测PCR反应。随着产物在每个连续的扩增循环中的积累，报告染料的荧光增强。记录每个循环的荧光发射量，可以检测指数期的PCR反应。 Cyber​​ Green 是一种敏感的双链DNA特异性染料，针对实时RT-PCR进行了优化。在溶液中，未与DNA结合的染料几乎没有荧光。当染料与双链DNA结合时，荧光会大大增强。与市面常见的SYBR Green相比，Cyber​​ Green一般较少抑制RT-PCR也不太可能导致非特异性扩增。Cyber​​ Green可以在更高的染料浓度高中，产生更强的PCR信号。较高的Cyber​​ Green浓度允许用于qPCR消除“染料再分配”的问题。尽管双链DNA结合染料为实时PCR提供了最方便，最便宜的选择，但它有一个很明显的缺点是特异性和非特异性产物均会产生信号。

表3.DNA结合染料

产品名称 Ex（nm） Em（nm） 规格 货号
Cyber​​ Green 核酸凝胶染料 [相当于SYBR®Green] * 20X水性PCR溶液* 498nm 522nm 5 x 1 mL Tests 17591
1ml 17592
Cyber​​ Green 核酸凝胶染料[相当于SYBR®Green] 498nm 522nm 100ul 17604
1ml 17590
 Cyber​​ Green 核酸凝胶染料 498nm 522nm 1ml TJ1700
Peko Green双链核酸凝胶染料 502nm 523nm 1ml TJ1701
Cyber Gold核酸凝胶染料 300nm 539nm 500ul TJ1702
Cyber Safe DNA 凝胶电泳染料 280nm 530nm 500ul TJ1703
JJ Green 核酸凝胶染料 497nm 520nm 500ul TJ1704
Ru Red 核酸凝胶染料 300nm 605nm 500ul TJ1710
JJ Red 核酸凝胶染料 518nm 605nm 500ul TJ1705

2.2使用目标特异性FRET探针进行特异性检测

分子信标是一个单链寡核苷酸序列，用两个荧光团标记，并保持“发夹”状结构。在目标序列的存在下，它们会展开、结合并发出荧光。分子信标由四部分组成：

  • Loop：由与靶序列互补的分子信标的18-30个碱基对区域组成。
  • Stem：在环的两个末端连接的是两个相互互补的（5至7个核苷酸残基）短寡核苷酸。
  • 5'末端荧光团：在分子信标的5'末端共价连接有荧光染料。
  • 3'末端淬灭剂：在分子信标的3'末端共价连接了一个非荧光猝灭剂。

2.2.1 Tide Fluor 寡核苷酸标记系列产品

Tide Fluor 染料经过优化，可用于FRET寡核苷酸和肽标记。我们的Tide Fluor 染料比香豆素，荧光素，罗丹明和花青等经典标记染料具有更强的荧光性和更高的光稳定性。它们是在不降低性能的情况下标记肽和寡核苷酸的最佳荧光染料。

表4.经典荧光标记染料

  香豆素及其衍生物
  荧光素染料及其衍生物
  罗丹明染料及其衍生物
  花青染料及其衍生物
  吲哚菁绿（ICG）及其衍生物

表5.Tide Fluor 染料和光谱性质

Tide Fluor染料 Abs（nm） Em（nm） ε 1 Φ 2 260 nm处CF3 280 nm处的CF 4
Tide Fluor 1 345 442 20000 0.95 0.246 0.187
Tide Fluor 2WS 502 525 75000 0.9 0.211 0.091
Tide Fluor 2 500 527 75000 0.9 0.288 0.201
Tide Fluor 3WS 555 565 150000 0.105 0.079 0.079
Tide Fluor 3 555 584 85000 0.85 0.331 0.201
Tide Fluor 4 590 618 90000 0.91 0.489 0.436
Tide Fluor 5WS 649 664 250000 0.25 0.023 0.027
Tide Fluor 6WS 676 695 220000 0.18 0.111 0.009
Tide Fluor 7WS 749 775 275000 0.12 0.009 0.049
Tide Fluor 8WS 775 807 250000 0.08 0.103 0.109
  1. ε= 最大吸收波长处的消光系数（cm -1 M -1）
  2. Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率
  3. 260 nm处的CF是校正因子，用于消除染料对260 nm处的吸光度的影响（用于寡核苷酸和核酸标记）
  4. 280 nm处的CF是校正因子，用于消除染料对280 nm处的吸光度的影响（用于肽和蛋白质标记）

2.2.2 Tide Quencher 淬灭剂系列产品

DABCYL是用于开发各种FRET应用的染料，但对于较长波长的染料（例如荧光素，罗丹明和花青）的低淬灭效率限制了其在敏感的荧光FRET探针开发中的应用，另外，DABCYL的吸收光谱对环境比较敏感。AAT Bioquest已开发出耐用的Tide Quencher 系列产品，用于开发更长波长的FRET探针。Tide Quencher 染料是消除经典淬灭剂限制的绝佳选择。

Tide Quencher 染料的主要优点：

  • 探索其他淬灭剂无法实现的FRET应用。
  • 多种反应形式便于自我构建所需的FRET生物分子。
  • 与所需的荧光供体完全匹配。
  • 更低的价格和更好的性能。

表6.Tide Quencher 染料和光谱性质

Tide Quencher 系列染料 Abs（nm） ε  260 nm时的CF  280 nm时的CF 
Tide Quencher 1 488 20,000 0.147 0.194
Tide Quencher 2 512 21,000 0.100 0.120
Tide Quencher 2WS 515 21,000 0.100 0.120
Tide Quencher 3 576 22,000 0.085 0.091
Tide Quencher 3WS 576 90,000 0.186 0.205
Tide Quencher 4 604 23,000 0.146 0.183
Tide Quencher 4WS 604 90,000 0.149 0.136
Tide Quencher 5 661 24,000 0.170 0.082
Tide Quencher 5WS 661 130,000 0.072 0.082
Tide Quencher 6WS 691 130,000 0.120 0.102
Tide Quencher 7WS 759 140,000 0.072 0.091

2.2.3 Covidyte 肽底物系列产品

Covidyte系列产品是AAT Bioquest针对COVID-19最新研发的肽底物，用于通过FRET检测冠状病毒蛋白酶的强度。该系列产品为寻找冠状病毒蛋白酶抑制剂提供了高灵敏的荧光信号强度。

表7.Covidyte 肽底物

产品名称 货号 规格 Ex(nm) Em(nm)
Covidyte ED450 13537 100 Tests 334 453
Covidyte EN450 13535 100 Tests 334 453
Covidyte TF670 13541 100 Tests 648 663
Covidyte IF670 13542 100 Tests 654 669

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