基因编辑（gene editing），又称基因组编辑（genome editing）或基因组工程（genome engineering），是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰。
 

目前广泛使用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9，它是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。该技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，但过大的蛋白分子成为CRISPR未来应用方式中最重要的瓶颈之一。

最近，来自美国加利福尼亚大学伯克利分校创新基因组学研究所的研究人员发现了一种新型基因编辑工具——CasΦ，它是一种功能最小的CRISPR-Cas系统，由1〜70 KD的CasΦ蛋白和一个CRISPR阵列组成，且仅在巨型噬菌体的基因组中编码，其体积是CRISPR-Cas 9的一半，这项研究成果于7月16日发表在《Science》杂志上。
 

DOI: 10.1126/science.abb1400
本研究中，CasΦ（Cas12j）是巨型噬菌体分枝中编码的Cas蛋白家族，巨型噬菌体用它来诱使细菌抵抗自身而不是自身的病毒。它使用单个活性位点进行CRISPR RNA（crRNA）加工和crRNA指导的DNA切割，以靶向外来核酸。从进化关系而言，CasΦ或许更为“古老”，其与V型CRISPR-Cas蛋白的同源性不足7%，但与V型CRISPR-Cas蛋白的源头TnpB核酸酶超家族的部分蛋白有更高同源性。研究发现，CasΦ借助于单一向导RNA的引导，并依赖于PAM位点的指引以实现目标DNA的识别（其中CasΦ-2所识别的PAM序列为5’-TBN-3’（B=G,T,C））。
 

研究人员在论文中还研究了来自宏基因组的三个不同的CasΦ直系同源物：CasΦ-1，CasΦ-2和CasΦ-3。为了检验CasΦ在细菌细胞中识别和靶向DNA 的能力，他们测试了CasΦ 是否可以保护大肠杆菌免于质粒转化。他们首先试图确认核酸酶是否像其他Cas核酸酶一样使用前间区序列邻近基序（PAM）来靶向DNA序列，因此他们转化了一个包含crRNA互补靶位点附近随机区域的质粒文库，从而减少含有功能性PAM的质粒。这揭示了CasΦ具有靶向crRNA引导的双链DNA（dsDNA）的能力。
 

随后，研究人员使用大肠杆菌表达系统和质粒干扰试验确定了CRISPR- CasΦ系统运行所需的组件。他们观察到casΦ基因的转录和减少的CRISPR阵列，但没有证据表明其他非编码RNA，例如基因座内的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。此外，CasΦ活性可以通过改变引导RNA来重新编程为靶向其他质粒序列，这表明其天然环境中的核酸酶是一种功能性噬菌体蛋白，以及能够切割crRNA互补DNA的CRISPR-Cas效应子。数据还表明，该单一RNA系统比其他活性CRISPR-CAS系统更加紧凑。
 

接下来，研究小组需要了解CasΦ在体外对DNA的识别和裂解要求。结果表明，CasΦ的裂解活性仅在识别顺式DNA时才能观察到，而且只需要最低的PAM条件，这可能有利于更广泛的核酸检测。
最后，为了研究CasΦ是否能用于人类基因组编辑，研究人员在HEK293细胞中使用了与crRNA共表达的CasΦ进行了基因破坏测定。他们发现，CasΦ-2和CasΦ-3诱导了基因组整合增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的定向破坏。其中，具有单个指导RNA的CasΦ-2能够编辑多达33％的细胞，这与先前报道的CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12a和CRISPR-CasX的水平相当。
 

巨噬细胞编码的CasΦ在其宿主的超感染情况下的功能示意图
 

总结：CasΦ的小尺寸及其最小的PAM需求将特别有利于基于载体的细胞内转运，以及更广泛的可靶向基因组序列。此外，其紧凑的特质使其特别适合工程和实验室进化，可创造用于基因组操作的新功能。当考虑核酸酶在临床上未来的潜力时，Al-Shayed补充说，由于它来自环境噬菌体，而不是致病菌或人类肠道细菌，这可能使其成为更好的治疗工具。 但其进一步功能和可能的应用方面仍有许多工作要做。例如，其脱靶效应的潜力尚未得到测试。重要的是，这项研究展示了噬菌体来源的Cas系统的潜力，并且表明CRISPR更广泛的生物学机制仍然未知。
 

参考：Pausch Patrick,Al-Shayeb Basem,Bisom-Rapp Ezra et al. CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor.[J] .Science, 2020, 369: 333-337.