前言
Western Blot 蛋白质免疫印迹法（简称：WB），是基于蛋白质SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白的特性，通过显色达到检测目标蛋白的一种技术。Western blot 近年来发展迅速，成为了蛋白研究方向的一种主要技术，但由于其实验步骤和关键点多，耗时长，每个步骤可能都会影响最终结果，所以实验中也会遇到各种问题，导致最终的结果“五花八门”，也让众多“新手”抓狂！

关于WB实验的常见问题，有过不少网络文献做过总结和分析，本文将结合前人的经验对常见的问题进行归纳，给出解决方法，建议收藏！

Western Blot 实验流程
首先让我们温故而知新，回顾一下WB的实验流程（如图一所示）
Western Blot免疫印迹杂交试验步骤多，包含多个影响实验结果因素，如 SDS-PAGE 胶浓度、转膜缓冲液、封闭液、一抗抗体及其特异性，二抗孵育及漂洗等。

常见问题
本文将现象总结归纳为以下五类，分析问题的原因，并为大家提供可参考的解决方法。
1. 膜上无信号或无目标条带  

问题	可能的原因	建议
操作问题	洗膜过度	洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，减少洗膜次数，洗膜时间和温度
	蛋白未转到膜上	转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率；转膜过程中胶与膜完全接触；转印夹层排布正确；按照膜的制造商的使用说明润湿膜；转印部件在电印迹过程中未过热；使用正对照和/或分子量 Marker；可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流优化转印时间和电流。
	蛋白未完全结合到膜上	低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。
	过度封闭	减少封闭时间，试用不同的封闭液
	底物孵育时间太短	延长底物孵育的时间。
抗体问题	一抗、二抗不匹配	选择与一抗相匹配的二抗类型，二抗需和一抗宿主的物种相同。可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。
	一抗失效	使用有效期内的抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现用现配。
	结合目标蛋白的抗体不足	降低一抗稀释度;使用效价高的一抗；延长抗体孵育时间;膜充分浸润在液体中。
	一抗或/二抗浓度低	增加抗体浓度；
	一抗或/二抗浓度太高	使用太多一抗或二抗可能导致底物迅速耗竭，呈现出很弱的信号
抗原问题	一抗不识别目标蛋白	参照数据库对比抗原序列和蛋白序列，选择合适的一抗
	抗原不足或降解	每条泳道上样量不低于 20~30 ug, 使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
		封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶）
缓冲液问题	封闭液与一抗或二抗有交叉反应	更换适合的封闭液
	缓冲液中含有叠氮钠	叠氮钠是一种 HRP 的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。
	ECL发光液失活或灵敏度不够	更换发光液，选择超敏发光液
	曝光时间不足	延长曝光时间

2. 目标条带信号弱 WB结果中可能出现有目标蛋白条带，但是目标条带在膜上颜色较浅，原因和解决建议如下：

问题	可能的原因	建议
操作问题	转膜不充分	规范转膜的操作；优化电转条件；可将两张膜叠加在一起，防止转膜过度，或使用小孔径膜
	洗膜过度	洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，减少洗膜次数，洗膜时间和温度
	封闭过度	减少封闭时间，试用不同的封闭液
	曝光时间过短	延长曝光时间，如使用化学发光成像系统，可调整显示灰度值
	抗体染色不充分	延长孵育时间或增加抗体浓度
抗体问题	抗体浓度低	增加抗体浓度
	抗体和抗原亲和力不足	增加抗体浓度
	抗体活性不足	使用有效期内的抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现用现配。
抗原问题	抗原量不足	增加上样量
缓冲液问题	缓冲液中含有叠氮钠	叠氮钠是一种 HRP 的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。

3. 图像高背景
3.1 均一性的高背景

问题	可能原因	建议
操作问题	封闭温度过高，封闭不完全	封闭液的选择与优化；使用5%脱脂奶粉封闭；优化封闭时间和温度
	膜的问题	防止膜过程中干燥；换用NC膜进行实验；使用干净镊子并戴手套操作
	孵育中洗膜不充分	适当增加洗膜时间和次数；确保在充分震荡的条件下孵育膜，并且抗体充分覆盖膜表面
	曝光过度	缩短曝光时间，或等待数分钟后使用成像仪拍摄
抗体问题	一抗，二抗浓度较高	提高一抗，二抗稀释度，优化稀释条件
	一抗，二抗和封闭液结合	更换封闭液；更换二抗或降低二抗浓度
	储存时间较长或储存条件不当导致抗体失活	选择新的抗体
抗原问题	缓冲液中去污剂不够	增加TBST中Tween 20的浓度
缓冲液问题	转膜液，封闭液等不新鲜或被污染	现用现配

3.2 非均一性高背景

问题	可能的原因	建议
操作相关	封闭温度过高，封闭不完全	封闭液的选择与优化；增加封闭液中蛋白浓度；优化封闭时间和温度
	膜没有正确润湿，也可能干过	使用干净镊子并戴手套操作；使用足够液体，膜始终保持湿润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，相互覆盖
抗体问题	抗体浓度太高	提高一抗，二抗稀释度，优化稀释条件
	二抗聚集	使用前过滤二抗或者更换二抗
	封闭剂中有聚集体	使用前过滤封闭剂或者更换
	一抗，二抗和封闭液结合	更换封闭液, 或更换二抗或降低二抗浓度
缓冲液问题	仪器或用具被污染	保证仪器和用具干净；确保膜上无残留胶
	转膜液，封闭液等不新鲜或被污染	使用干净、新鲜的转膜液，封闭液。建议现用现配

4. 非特异性条带多

可能原因	建议
抗体与蛋白非特异性结合	更换抗体
抗体浓度太高	降低上样量；提高一抗稀释度。
抗体未纯化	使用单克隆或亲和层析纯化后的抗体，减少非特异条带
转膜强度太强，导致杂带太强	降低转膜强度（时间和电流），使目标蛋白上方的蛋白少转移到膜上。
封闭不完全	增加封闭液中蛋白浓度
细胞传代次数过多，导致其蛋白表达模式分化	使用原代或者传代少的细胞株，和现在的细胞株一起做参照
新蛋白或同族蛋白分享同种表位的不同剪接方式	查其文献报导，使用说明书报导的细胞株或组织

5. 条带形状异常
5.1 哑铃状条带 该现象可能有两个原因导致。一是由于配置胶有问题，胶凝固后不均一，可通过重新配置胶，确保胶质量无问题。二是样品可能含有过多杂质，我们在样品使用前对其进行离心，以去除过多杂质。

5.2 条带发白 该现象可能原因是一抗浓度过高，二抗上HRP催化活力太强，同时显色底物处于临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白。可降低一抗和二抗浓度，或者更换底物。

5.3 条带拖尾 该现象主要原因是蛋白量太大，或一抗浓度和时间太长，可根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。

5.4 条带相连 出现该现象的原因可能是上样量太大或是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。

5.5 条带呈现微笑状 电泳条带或整体出现 “︶ ”形状，可能原因主要为：电泳速度过快，可通过减少电压等减慢电泳速度；或是电泳温度过高，使得胶变形，可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。

5.6 条带中出现边缘规则的白圈 该现象很大可能是电转中膜和胶之间存在气泡，建议在转膜前去掉膜和胶之间的气泡。

总结一下

Western blot 技术目前是蛋白研究中最常用的方法之一，但也因为其步骤繁杂让结果变幻莫测。但只要规范实验流程，选用适合的试剂耗材和稳定的成像系统，相信大家都会做出“美丽”的条带。

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