摘要：

本研究采用猪尾小组织块贴壁培养法成功分离培养出原代猪成纤维细胞，并进行了不同时期的绿色荧光蛋白(GFP)阳性质粒转染效率的研究。实验结果显示，原代细胞具有较高的转染效率，且传代和复苏细胞亦能成功转染。该研究为猪成纤维细胞的基因编辑和体细胞克隆提供了有价值的参考。

引言：

成纤维细胞作为重要的供体细胞之一，在医学、动物科学及基础研究中具有广泛的应用价值。在医学上，成纤维细胞可用于疾病诊断、人工皮肤制备、组织创伤修复及组织器官培养等方面。在动物科学领域，成纤维细胞则可用于体细胞克隆及转基因研究，以实现濒危畜禽的保种及扩繁、优良品种的快速繁育及转基因新品种的培育。此外，在基础研究中，成纤维细胞为遗传学、细胞学、胚胎学、组织学及免疫学等提供了基础材料和分离培养模式。

鉴于成纤维细胞的重要性，建立一种快速、实用、简便的猪成纤维细胞分离培养方法显得尤为重要。猪尾小组织块贴壁培养法作为一种有效的分离培养方法，具有操作简便、细胞分裂增殖能力强、适应性好及性状稳定等优点。然而，关于该方法分离出的成纤维细胞的转染效率研究尚不充分。因此，本研究旨在通过猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞，并探究其不同时期的GFP阳性质粒转染效率，为猪成纤维细胞的基因编辑和体细胞克隆提供理论依据和技术支持。

材料与方法：

1. 材料

实验动物选用新生小猪，超净工作台、威尼德电穿孔仪、超低温冰箱、CO2培养箱、眼科剪、培养瓶、离心管、血球计数板等仪器，以及乙醇、PBS溶液、某品牌DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、中性蛋白酶、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、台盼蓝、EDTA、DMSO等试剂。

2. 方法

2.1 猪尾小组织块贴壁培养法分离培养成纤维细胞

新生小猪出生后立即取其尾尖组织，以75%酒精擦拭消毒后，用手术剪刀剪下约2cm长的猪尾组织，投入75%酒精中浸泡60秒后，以无菌PBS冲洗3次，转移至含有15%FBS的某品牌DMEM细胞培养基中，置于冰盒后带回实验室。在安全柜内，用PBS（含双抗）洗涤猪尾组织数次后，剪下长约1.5cm的组织块，转移至另一无菌直径为10cm的玻璃培养皿中，加入几滴血清后以弯头手术剪刀剪碎至1mm³小块。加入20mL消化缓冲液，放入39℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行消化。消化后的组织块贴壁培养于含有10%FBS的某品牌DMEM培养基中，定期观察并更换培养基。待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代培养。

2.2 细胞冻存与复苏

选择生长状态良好的细胞进行冻存。将细胞用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞沉淀，加入含有10%DMSO和90%FBS的冻存液，混匀后分装至冻存管中，置于-80℃冰箱过夜后，转移至液氮罐中长期保存。复苏时，将冻存管从液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴中解冻，将细胞悬液转入含有10%FBS的某品牌DMEM培养基中，培养至细胞贴壁后更换新鲜培养基。

2.3 GFP阳性质粒转染

采用威尼德电穿孔仪进行细胞转染。将细胞消化后计数，调整细胞密度至1×10^6个/mL。取100μL细胞悬液与适量GFP阳性质粒混匀后，加入电穿孔杯中。设置电穿孔参数为电压1200V/cm，脉冲时间3ms。电转染后，将细胞转入含有10%FBS的某品牌DMEM培养基中继续培养。分别在转染后24小时和48小时，采用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的GFP质粒阳性表达率。

结果：

1. 猪尾小组织块贴壁培养法分离培养成纤维细胞

采用猪尾小组织块贴壁培养法成功分离培养出原代猪成纤维细胞。细胞形态呈多边形，生长均匀，贴壁良好。原代细胞活力很高，细胞存活率达到97.670%。经过传代培养后，细胞存活率仍为95.670%。复苏后的细胞存活率亦在90%以上，且能保持原代细胞的生物学特性。原代培养、传代培养和复苏培养细胞的生长曲线均呈“S”型，但复苏细胞的生长速度略微缓慢。

2. GFP阳性质粒转染效率

原代培养、传代培养和复苏培养细胞在电转染后均能成功表达GFP质粒。转染后24小时，荧光显微镜即可检测到GFP质粒阳性表达的成纤维细胞。转染后48小时，流式细胞仪检测显示原代细胞阳性率为8.01%，稍高于传代细胞的7.91%和复苏细胞的7.86%。复苏细胞存活率有所下降，转染后细胞活力亦有所降低，但转染后仍可得到7.86%的GFP质粒阳性表达率。

讨论：

1. 猪尾小组织块贴壁培养法的优势

本研究采用猪尾小组织块贴壁培养法成功分离培养出原代猪成纤维细胞。该方法操作简便，对细胞损伤小，且细胞分裂增殖能力强，适应性好，性状稳定。此外，该方法还能模拟体内生长状况，简化生长环境，明确生长条件，便于施加实验因素及获得直接活体观察结果。因此，猪尾小组织块贴壁培养法在猪成纤维细胞的分离培养中具有广泛应用前景。

2. 转染效率的影响因素

原代细胞为混杂细胞，且比较脆弱、不稳定，因此其转染条件无法沿用纯化建系的细胞。本研究在电转染过程中，对电压和脉冲时间进行了优化。结果显示，在电压1200V/cm、脉冲时间3ms的条件下，细胞转染效率最高。此外，GFP阳性质粒的浓度对原代细胞的电转染率影响较小，当其浓度达到一定值后，转染率间无显著差异。这一结果与传代细胞系相似。

3. 研究的创新与应用前景

本研究的创新之处在于采用猪尾小组织块贴壁培养法成功分离培养出原代猪成纤维细胞，并探究了其不同时期的GFP阳性质粒转染效率。研究结果为猪成纤维细胞的基因编辑和体细胞克隆提供了有价值的参考。在应用前景方面，该方法可用于转基因猪的制备、疾病模型的建立以及濒危畜禽的保种及扩繁等领域。此外，该方法还可为其他物种成纤维细胞的分离培养和转染效率研究提供借鉴和参考。