原代细胞的培养操作
2022-03-22 来源:智立中特 点击次数:1269
原代细胞的培养步骤
一、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养要求
1、细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性；
2、细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L；
3、培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养；
4、小牛血清浓度为10%-80%；
5、应在37℃5%CO2的培养箱中培养；
6、在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮；
7、待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液；
8、用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。
二、悬浮细胞的培养要求
1、原代培养时要尽量去除红细胞；
2、短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行；
3、细胞浓度可在5-8×109/L范围内进行分瓶试验；
4、长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长；
5、细胞换液一般每隔3天需半量换液一次；
6、细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。
三、原代细胞的维持
1、贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要；
2、换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液；
3、悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法；
四、原代细胞培养的首次传代
原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度；贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
首次传代应注意以下几点：
(1)细胞生长密度不高时，不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。
(3)吹打已消化的细胞应减少机械损伤。
(4)首次传代时细胞接种数量要多一些。
(5)首次传代培养的pH应偏低些。小牛血清浓度可加大至15%～20%左右。
一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
2、用PBS清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
（二）消化分离法
1、酶消化分离法（过夜冷消化法）
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
④次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
（三）原代细胞培养
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。
（四）原代细胞的传代、保存
（1）传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。
（2）保存：DMSO＋培养液＋血清
按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。
（五）原代细胞的复苏
（1）取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。
（2）吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。
（3）用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃CO2培养箱静置培养。
一、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养要求
1、细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性；
2、细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L；
3、培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养；
4、小牛血清浓度为10%-80%；
5、应在37℃5%CO2的培养箱中培养；
6、在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮；
7、待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液；
8、用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。
二、悬浮细胞的培养要求
1、原代培养时要尽量去除红细胞；
2、短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行；
3、细胞浓度可在5-8×109/L范围内进行分瓶试验；
4、长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长；
5、细胞换液一般每隔3天需半量换液一次；
6、细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。
三、原代细胞的维持
1、贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要；
2、换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液；
3、悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法；
四、原代细胞培养的首次传代
原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度；贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
首次传代应注意以下几点：
(1)细胞生长密度不高时，不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。
(3)吹打已消化的细胞应减少机械损伤。
(4)首次传代时细胞接种数量要多一些。
(5)首次传代培养的pH应偏低些。小牛血清浓度可加大至15%～20%左右。
一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
2、用PBS清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
（二）消化分离法
1、酶消化分离法（过夜冷消化法）
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。
④次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法（EDTA消化法）
①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。
③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
（三）原代细胞培养
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。
（四）原代细胞的传代、保存
（1）传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。
（2）保存：DMSO＋培养液＋血清
按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。
（五）原代细胞的复苏
（1）取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。
（2）吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。
（3）用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃CO2培养箱静置培养。
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