干细胞成骨、成脂、成软骨三系分化 的操作方法
2022-06-10 来源:本站 点击次数:2705成骨诱导分化步骤
1.接种骨髓间充质干细胞：取对数生长期的细胞，按照2×104cells/cm2的细胞密度接种至包被后的培养器皿中，于37℃，5% CO2培养环境下培养至汇合度60-70%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。
2.细胞分化诱导：每2-3天更换成骨诱导培养基，于37℃，5%CO2培养环境下培养约14-21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况，决定终止细胞诱导的时间，进行染色鉴定。
4.茜素红染色：加入适量茜素红染液染3~5min，吸去茜素红染液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。
5.诱导评估：显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节会与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。
成脂诱导分化步骤
1.接种骨髓间充质干细胞：取对数生长期的细胞，按照2×104cells/cm2的细胞密度接种至包被后的培养器皿中，于37℃，5% CO2培养环境下培养至汇合度90-100%，弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液。
2.细胞分化诱导：于37℃，5%CO２培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基诱导液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基维持液，继续培养3天。
按照以上换液频率诱导14-21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。
3.细胞固定：吸去培养基,使用适量1×PBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60min，弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。
4.油红O染色：取生理盐水或1×PBS与油红O原液配制油红O工作液（油红O原液: 生理盐水=3:2），现用现配。向清洗干净的诱导孔内加入适量工作液，静置染色30min；吸走油红O工作液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。
5.诱导评估：显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估；诱导成功时，脂滴会与油红O染料结合后呈现红色或橘红色。
成软骨平面诱导分化步骤
1.将对数生长期的细胞消化下来计数，成软骨诱导分化培养基细胞重悬细胞，离心后调整细胞密度密度1-2.0×107cells/mL。
2.20μL悬滴到24孔板中央。（20μL含有4×105细胞）。37℃培养3h使细胞贴壁。
3.补充200uL诱导分化培养基正常培养，每隔2-3天换液一次。按照以上换液频率诱导21-28天，并注意观察细胞形态变化。
4.细胞固定：吸去培养基使用适量1×PBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60min，弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。
5.阿利新蓝染色：向清洗干净的诱导孔内加入适量染色液，避光静置染色30min。吸去阿利新蓝染色液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。
6.诱导评估：显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。
NOTE:间充质干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源、培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。
成软骨三维诱导分化步骤
弃上清，加入0.5mL成软骨诱导分化培养基基础液，重悬细胞，150g离心5min。小心弃去上清，加入0.5mL成软骨诱导分化培养基诱导液，重悬细胞，150g离心5min。
将15mL离心管的管盖稍稍旋开，放置于37℃，5% CO2培养环境下培养。
2.细胞分化诱导:24h后观察细胞沉淀形变团聚的情况，如有明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。
置于37℃，5%CO2培养环境下培养约21天，通常每2天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。
3.染色鉴定
a)软骨球固定：将软骨球从离心管中转移至EP管，并使用1×PBS清洗两次，最后置于适量的4%中性甲醛溶液中。
b)石蜡包埋切片：软骨球经石蜡包埋后切片。
c)阿利辛蓝染色：将石蜡切片脱蜡，使用阿利辛蓝染液染色30min，用自来水流水冲洗2min，蒸馏水冲洗1次。
d)诱导评估：显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。
NOTE: 间充质干细胞的成软骨分化水平因细胞类型、细胞供体来源、培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。