2018年CE Pharm年度大奖授予成像毛细管电泳技术（icIEF）发明人Dr. Jiaqi Wu，以奖励其对毛细管电泳技术在生物制药领域应用做出的贡献。
 

2022年吴博士最新撰文，系统回顾了icIEF技术及在生物制药、疫苗和病毒表征方面应用进展，再次说明了icIEF技术已成为生物制药行业的主流技术，同时为未来技术发展指明了方向。

本文将帮助生物制药、疫苗和基因治疗领域科研人员更好地理解毛细管电泳技术，更好地运用此技术加速生物药物研发。

传统毛细管等电聚焦电泳（cIEF）技术局限
 

1985年，Hjertén和Zhu在毛细管电泳（CE）仪上首次实现cIEF。与平板胶IEF相比，clEF具有自动化程度高和可定量等优点。然而，经过15年后，作为蛋白质药物电荷异质性表征方法，cIEF并没有被制药行业领域广泛接受。

 

主要原因是通用的商业化CE仪器只配备了单点紫外吸收和荧光检测器，使运行clEF方法很有挑战性。IEF分离过程后，依靠化学和压力方式移动毛细管内聚焦的蛋白条带，使其经过单点检测器，这个迁移方式可能会产生问题，如峰形扭曲、模糊或分辨率不佳，需要增加运行时间，并且方法优化具有挑战性。而且，分离柱内部发生聚焦和迁移步骤无法被观察到，不易优化。

 

cIEF重现性差是样品聚集/沉淀和等电聚焦过程中时间过长而产生的变化造成的。单点检测cIEF在整个迁移过程中都要施加分离电压，以防止分离柱内集中的样品条带扩散，这意味着分离的条带仍然是焦点，聚焦过程不能在最佳时间停止，对样本进行过度聚焦。典型实验迁移时间需要20分钟到40分钟不等（视样本而定），较长的聚焦和迁移时间增加了样品聚集/沉淀和样品变化的可能性。

 

下图使用icIEF聚焦时间诱导聚集例子来说明这一难题，当聚焦时间超过10min时，蛋白质聚集导致电泳图开始出现尖峰。因此，当聚焦时间超过10分钟时，峰型不稳定，导致数据重复性较差。

单克隆抗体(mAb)在直径100 μm、长5 cm毛细管内等电聚焦过程
 

 

全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术（icIEF）优势

clEF聚焦过程结束时，所有样品条带都聚焦在毛细管分离柱内，并且几乎是静止的。因此，采用全柱成像是cIEF理想的检测方法。

 

1992年和1994年Wu和Pawliszyn首次提出了基于反射指数和紫外吸收的全柱成像检测技术，并于1998年首次商业化全柱成像紫外吸收cIEF，称为icIEF。

 

icIEF具有方法开发简单、通量高、等电点(pI)测定和定量重现性好、易于开发平台方法等优点。去除了传统clEF迁移步骤，将分析时间从40到60分钟减少到每个样品5到15分钟。icIEF方法每次进样分析时间短，并能够实时观察整个聚焦过程，很容易地识别出峰型不重现的原因，如蛋白质聚集情况下，可以通过优化聚焦时间或添加稳定剂来避免。

 

icIEF技术成功商业化后，已经逐渐取代传统的cIEF技术，在生物制药行业得到了广泛应用。

 

生物制药和疫苗中icIEF技术应用

 

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制剂配方和稳定性研究

蛋白质治疗药物需要详细制剂研究来确保产品稳定性。在产品开发早期阶段，需要评估和表征产品在各种强制条件如温度和pH下稳定性。

 

多项研究表明包括单克隆抗体和糖蛋白、抗体偶联药物和疫苗，iclEF结果可作为多种蛋白质治疗药物的稳定性指标。制剂研究的样本量比较大，对通量要求高。与传统cIEF、平板凝胶IEF和大多数离子交换色谱法相比，icIEF具有显著的高通量优势。

 

早期制剂阶段具有许多候选样本，对每个候选样本进行单个方法优化将使很难实现，最好采用广泛适用的平台化方法。

 

2009年报道了第一个平台iclEF方法表征了25个单克隆抗体，结果表明iclEF方法适用于单克隆抗体鉴定和纯度测定，目前icIEF方法已被广泛用于制药行业制剂和稳定性研究。

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 质量控制(QC)

根据生物制药ICH指南，必须在整个生产、运输和存储过程中监测电荷异质性。iclEF是检测蛋白质电荷异质性的标准工具。

 

2002年icIEF首先报道用于单克隆抗体药物的质量控制，之后，多个多中心联合验证项目对单克隆抗体药物icIEF 质控方法进行了评估和验证。

 

第一项是11家国际制药公司12个实验室联合研究，结果强调了iclEF对治疗性抗体电荷异质性作为稳定性指标的重要性，并首次提出iclEF方法可替代传统的cIEF方法。

 

第二项是中国8家公司10个实验室对iclEF方法进行了单克隆抗体药物检测方法的联合验证，结果表明了方法可靠性和科学性，并可定量检测单克隆抗体中含量2.3%的微小组分。

 

最近，重组人红细胞生成素(rhEPO)的电荷异质性质控方法已被验证，6家制药公司6个实验室验证了icIEF用于rhEPO分析可靠性。

 

这些研究证明了iclEF方法能根据ICH指南准确并稳定地表征蛋白药物(mAb或rhEPO)的电荷异质性，并概述了使用iclEF方法进行质量控制的预期结果。

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蛋白糖基化

蛋白质药物制剂中糖基化可能会对产品质量产生负面影响，如糖基化发生在单克隆抗体结合位点，可能影响其安全性和有效性。iclEF方法是单克隆抗体糖基化结合位点研究工具之一。

 

如果不注意控制糖的浓度，会产生过量糖基化产物。糖基化很难通过离子交换色谱法来观察，因为糖基化可通过与色谱固定相的相互作用发生可逆反应。iclEF方法已被证明可以观察到使用离子交换色谱无法检测到的糖基化电荷异质性。可清楚地观察到糖基化构型与非糖基化构型酸性pl的微小偏移(pH单位0.05)。

 

一项研究输液介质中高浓度葡萄糖对单抗糖基化影响。葡萄糖粘度使IEX分析起来很困难。由于葡萄糖不带电荷，电泳时不迁移，因此在整个IEF分离过程中，分离柱可以填充不同浓度葡萄糖，用于研究葡萄糖对单抗糖基化的影响。

 

另一项研究中是使用iclEF方法监测单抗的体内外稳定性，分析在PBS和血浆中孵育后的不同单克隆抗体，以及体内循环中产生的单克隆抗体。在血浆培养和体内循环中，发现酸性变异体的相对百分比显著增加，可能与糖基化增加有关。

 

生物仿制药开发人员需通过与生物药参考品进行综合对比性研究来证明相似度，包括两种药物的降解路径。icIEF方法是一种很好的对比性研究工具，可反映蛋白质微小变化。如用来比较创新的融合蛋白及其生物类似物之间的唾液酸化程度，以及创新的单克隆抗体及其生物类似物之间的唾液酸化程度及降解速度。

4

工艺优化研究

不同细胞系的高糖基化蛋白药物可能具有不同的糖基化特征。高通量iclEF已用于产品工艺开发早期来筛选细胞系。

 

一项研究是筛选从不同CHO细胞系获得的白细胞介素受体的糖基化谱，结果显示iclEF对唾液酸含量的分辨率比阴离子交换色谱高得多。同样地，许多抗体偶联药物(ADC)被设计成将未配对的半胱氨酸置于单抗的重链上，以便随后与药物偶联。这些半胱氨酸增加了单抗的电荷异质性，通过icIEF可以观察到它们对pl的影响。相对于离子交换色谱法，icIEF法对于ADC和其他复杂分子通常具有较高的分辨率。

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不同蛋白质药物的电荷异质性表征

单克隆抗体

单抗是最重要的蛋白质治疗药物类别，FDA批准了70多种基于单抗的治疗药物。原理上，iclEF技术与离子交换色谱技术是一种正交技术。然而，iclEF技术主要优势是其平台化检测能力。对于不同的单抗，iclEF方法只需要小的修改就可应用到新的单抗上。相比之下，对于离子交换色谱技术，不同单抗可能需要优化不同的方法参数。icIEF被用于制药行业一些基本研究领域，如单抗重链和轻链电荷异质性，生物仿制药特定的电荷异质性，单抗结合抗原和血清白蛋白等。

 

抗体偶联药物 (ADC)

与单克隆抗体一样，制剂研究中iclEF方法可表征ADC，用于药物偶联水平监测和最终产品质量控制如曲妥珠单抗偶联药物。与离子交换色谱和疏水色谱相比，iclEF用于ADC分析的一个优点是更高分辨率。色谱方法可能是由于色谱柱固定相和ADC之间的非特异性相互作用，由于ADC疏水性导致。当用离子交换色谱法表征ADC及其裸单抗的电荷分布时，可很好地分离了单克隆抗体的电荷变异体，但ADC分辨率较差。当使用iclEF方法时，单抗和ADC电荷分布和分离分辨率相同。这导致许多实验室首选iclEF方法表征ADC电荷异质性。

 

双特异性抗体 (BsMAB)

BsMABs通常具有更多的电荷异质性，可使用iclEF进行检测。采用iclEF方法研究了BsMAB的脱酰胺和异构化，也可检测双抗与其靶点之一血清白蛋白的结合能力。

 

重组融合蛋白

融合蛋白药物通常比其他类型的药物有更多异质性。离子交换色谱在异构体定量方面具有良好的精度，但对融合蛋白异构体可能没有足够的分辨率。与ADC和BsMABs的情况一样，icIEF也是这些更复杂的融合蛋白电荷表征的强大工具。早在2001年被首次用于融合蛋白药物Enbrel的电荷表征。此外，使用icIEF比较了融合蛋白创新药和生物仿制药的糖基化特征。最近，一种重组融合蛋白药物的平台iclEF方法被开发出来，并应用于9种商业化融合蛋白。

 

疫苗和病毒

疫苗是一类复杂制剂，可根据其核心成分划分为不同类别。一些疫苗利用多糖结合到蛋白质载体，提供保护免受细菌感染。白喉类毒素和一种无毒白喉毒素变种CRM197是常用的蛋白质载体。Rustandi等利用iclEF方法表征CRM197蛋白载体。另一项研究也表明，iclEF方法有助于蓖麻毒素疫苗的制剂优化。

 

近年来，mRNA脂质纳米颗粒(LNPs)已被采用为一种有效的疫苗递送剂，与传统的疫苗递送方法相比具有一些优势。色谱法难以对表面电荷进行表征时，iclEF方法已成功开发出用于表征mRNA脂质纳米颗粒的表面电荷，作为不同带电脂质体的特征分析，并评估mRNA疫苗的定量稳定性。

 

病毒样颗粒(VLPs)是强有力的疫苗递送方式，与其他蛋白质药物一样，这些疫苗也需要电荷表征。VLPs通常是非常大的分子，因此很难用没有固定相的色谱方法来表征电荷异质性，icIEF已被证明是VLPs电荷表征和pl测量的强大工具。2004年，第一次使用icIEF方法测定了VLP pl值, icIEF已用于乙型肝炎VLP疫苗的电荷表征。此外，变性诺瓦克病毒VLP疫苗的iclEF电泳图谱可作为不同类型、不同批次VLP的指纹图谱，甚至可潜在地识别大量失效的VLP产品。

 

一些由活病毒或灭活病毒组成的疫苗，iclEF方法已用于确定真实病毒的pl值，如活脊髓灰质炎病毒和人乳头瘤病毒。没有其他方法报道过这两种病毒的pl测定。在这些研究中，病毒的pl信息分别对优化灭活过程和开发病毒疫苗具有重要意义。

 

icIEF技术新进展及应用

 

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自发荧光检测

icIEF已被制药行业广泛接受，但因为紫外280nm光吸收检测灵敏度较低，限制了在产品开发后期应用潜力。2016年ProteinSimple推出了一种商业化仪器Maurice，利用紫外诱导检测蛋白质自发荧光，具有更高的灵敏度。

 

优势是不需要用荧光染料标记样品。天然荧光检测灵敏度的提高可能使最终制剂中的激素药物和疫苗的电荷表征成为可能。与单抗药物不同，这些类型的治疗药物效力高，在最终产品制剂中的浓度要低得多，这使得很难对最终药物产品进行电荷表征。最近，一个研究小组证明了自发荧光对重组人红细胞生成素(rhEPO)最终产物的电荷表征非常重要，这些产物含有高浓度的人血清白蛋白。荧光模式的定量限(LOQ)约为紫外吸收模式的1/50。

 

为了进一步提高荧光的灵敏度，可以考虑使用激发器作为激发光。实现这一目标的一种方法是将激发光引入毛细管的一端，同时使用全柱成像系统收集发射荧光。

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免疫检测法联用iclEF

化学发光是最灵敏的检测方式之一。icIEF结合化学发光全柱成像技术已经上市，使用抗体杂交已经聚焦分离的蛋白质。与荧光检测不同，化学发射光的信号背景非常低，使其成为一种高灵敏度的检测形式。除了高灵敏度之外，抗体免疫检测具有很高的特异性。

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iclEF与质谱联用

质谱被认为是氨基酸及蛋白质鉴定的金标准。如IEF与MS检测器结合，就可实现pI和大小二维分离。此外，clEF可分离不同修饰的蛋白质构型，可用质谱进行鉴定。

 

虽然cIEF- MS的研究开始于20世纪80年代末，但如前所述，传统的cIEF采用柱上单点检测器，存在局限性。iclEF与MS联用开始于大约10年前，主要优点是在将分离的蛋白条带引入MS之前，可很容易地优化IEF分离，直接将分离的蛋白条带从iclEF柱推入MS检测器。该设计中，分离通道与MS接口之间的距离可能会降低分离的分辨率。一种基于微芯片的iclEF与MS结合并商业化，解决了这一问题。微芯片既是分离通道又是电离喷雾器，几乎消除了分离通道与MS界面之间的距离。

 

总结

 

经过近30年的发展，在制药行业中产品开发、质量控制和放行过程，icIEF已成为蛋白质电荷表征的首选方法。

 

更高灵敏度的检测模式如荧光和化学发光，将扩大iclEF在制药工业和生物研究中上游领域的应用，将在蛋白质药物研究、疫苗开发和基因治疗领域有更大的应用空间。

 

随着icIEF与质谱联用技术的发展，有望取代液相色谱-质谱联用技术在制药行业的某些应用。这些创新开启了iclEF令人兴奋的下一个篇章，必将在药物工业领域发挥更大的作用。
 

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