小麦  是世界上主要的谷类作物之一，其制成的面粉广泛应用于食品行业。小麦及其制品受多种微生物的影响，特别是能产生真菌毒素的产毒真菌。测定小麦及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol-DON)的含量对公众健康至关重要。
 

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON） （3α，7α，15-三羟基-12，13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮）（图 1）是一种属于单端孢霉烯族的真菌毒素，由镰刀菌属真菌产生，也称为呕吐毒素。其主要存在于小麦和大米等谷物中。DON在高温下稳定，因此可在加工过程中存留，从而污染小麦及其制品。事实上，亚洲已经报告了几起与 DON 污染相关的急性病暴发。人类摄入受 DON 污染的食物会出现恶心、呕吐、眩晕、胃肠道紊乱和腹泻等症状。此外，体外研究表明， DON还可能具有潜在遗传毒性¹。
 

 图1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的化学结构，CAS nº 51481-10-8
 

2017年2月8日，巴西制定了RDC No.138法规，规定脱氧雪腐镰刀菌烯醇在包括小麦、全麦面粉、意大利面、饼干等一些产品中的最大限量。全麦和全麦面粉中，DON的最大限量为1250μg/kg。²

食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定包括以下步骤：提取、净化、洗脱和色谱定量。在本应用中 ，待测物的净化和洗脱步骤通过 GX-274 ASPEC®全自动固相萃取系统自动化完成。通过分析方法验证， 确保结果的可靠性。对照样品的使用对于仪器的准确度评估至关重要。³ 在本应用中使用小麦对照样品 B-MYC0856 对 GX-274 ASPEC®系统的准确度、精确度（可重复性和中间精密度）、检测限及定量限的验证。

材料和方法
 

样品

对照样品B‑MYC0856天然污染的小麦粉，DON标准值含量为877μg/kg±23 μg/kg，购自LGCStandards（Wesel, Germany）。
 

主要仪器与试剂

• Gilson GX-274 ASPEC®全自动固相萃取系统 (Gilson, Inc.; Middleton, WI, USA)
色谱纯甲醇和乙腈购自Merck，Darmstadt，Germany。DON（D0156）购自Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 。

• DonStar™ R 免 疫 亲 和 柱 (PN COIAC5004).
(Romer Labs；Union,MO,USA)
• C18 反相分析柱(PN R0086200C5), MicrosorbMV 100-5, 250 x 4.6 mm, 5 μm.(Varian Medical Systems; Walnut Creek, CA)
• C18反相保护柱，ZORBAX, 4x3 mm.(Agilent Technologies；Palo Alto,CA,USA)
 

色谱分析条件：

Alliance 2695 HPLC 系统

• 流动相：水:甲醇:乙腈 (80:15:5; v/v/v)
• 流速：0.7 mL/min
• 柱温：30°C
• 进样量：50 μL
• 检测：220nm 紫外波长
 

方法

在12.5g样品中加入100 mL去离子水(电阻率18 MΩ.cm)， 置于水平摇床上以 200 rpm 的速度振荡30分钟。然后将样品转移到聚丙烯(PP)离心管中，3000 rpm离心10分钟。上清液通过超细纤维滤纸过滤，滤液收集于10mL试管中，转移至 GX-274 ASPEC®全自动固相萃取系统进行净化。DonStar™ R免疫亲和萃取柱已事先用 Gilson 3mL柱盖密封。在Gilson TRILUTION® LH 软件控制下，GX-274 ASPEC®全自动固相萃取系统上的样品前处理分为两个步骤：净化和洗脱（图2）。
 

图2 TRILUTION®LH 软件中样品前处理步骤：样品的净化和 DON 的洗脱

自动化样品制备总结
 

步骤 1：样品净化

• 将2 mL滤液添加至免疫亲和柱上，流速 0.5mL/min。

• 用10 mL超纯水清洗免疫亲和柱，流速 2mL/min，清洗两次。

• 因实验室中的氮气源压力低， 从Gilson GX-274 ASPEC^®全自动固相萃取系统中取出免疫亲和柱。放入浓缩仪中以1400 转/分的速度离心干燥5分钟。
 

步骤 2：洗脱

• 将免疫亲和柱重新放回于Gilson GX-274 ASPEC^®全自动固相萃取系统。用 2mL甲醇洗脱DON，流速0.5 mL/min。洗脱液收集于5mL试管中。

从Gilson GX-274 ASPEC^®全自动固相萃取系统中取出试管并置于45°C水浴中。在氮气流下，蒸发至干燥。将蒸干的提取物溶解在1.0 mL水中，涡旋，随后用0.45 μm PTFE膜过滤。收集滤液用于进一步的液相色谱分析。通过外标法对 DON进行定量。

结果与讨论

在本应用中，我们报道了从小麦样品中自动化分离DON的样品制备方法。使用 GX-274 ASPEC^®全自动固相萃取系统自动化样品前处理和洗脱步骤，使用 HPLC 法检测DON。HPLC检测结果表明，使用免疫亲和柱进行净化可以有效去除基质背景（图 3）。根据巴西国家计量、标准化和工业质量研究所的建议，我们对准确度、精确度、检测限和定量限等参数进行了验证。³ 
 

图3 高效液相色谱-紫外检测小麦样品中 DON 的含量(λ = 220 nm, DON 的保留时间：10.1 min)。

检测限和定量限约分别为信噪比（S/N）的3和10倍（表1）。定量限与校准曲线的第一点匹配（图 4）。
 

表1 LC/MS 分析条件
 

图4 校准曲线(浓度范围 50-1000 ng/mL，对应最终样品浓度 200-4000 μg/kg)
 

通过回收率试验评估了该方法的准确度。在单一浓度水平下对对照样品进行六次重复检测，计算 DON 的平均浓度、标准偏差和变异系数。测得 DON 的回收率在 99.5%至 104.9%之间，可计算出平均回收率为102.0%，表明该方法具有良好的准确度（表 2）。
 

表2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON） 的回收率
 

精确度是指在确定条件下，对同一样品进行独立和重复测量所得结果的离散度。它通常用标准偏差或变异系数数值表示。精确度的测量要求在相同的测量程序、相同的测量人员和相同参数下的相同仪器进行。对照样品在同一天进行了六次检测。DON测定的浓度平均值、标准偏差和变异系数见表3。这些数据表明该方法具有良好的重复性。中间精密度由两名检测人员在不同的两天内对同一样品进行六次检测来评估。同日和不同日的变异系数均在 3%以下(表3)。对结果进行方差分析，同一实验室不同检测人员不同日的结果差异不显著。
 

表 3 对照样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON） 浓度的测定以检测精确度

总结及应用优势

将小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）提取的步骤自动化能够精确控制上样体积和流速。变异系数低于3%，确保了不同批次样品结果的一致性。平均回收率为102%，证明了该方法的准确性。

该方法符合巴西现行立法。可以轻易地将一个手动操作步骤融入到自动化过程中，以满足实验室要求。在同一应用中，TRILUTION®LH 软件可以兼顾顺序和批量需求，以提高可重复性。GX-274 ASPEC®全自动固相萃取系统能够同时处理 4 个样品，提高效率和通量。

订货信息

*其他附属配件请咨询 Gilson 授权销售人员。

参考文献：

1. Almeida, A.P., Lamardo, L.C., Shundo, L., Silva, S.A.,Navas, S.A., Alaburda, J., Ruvieri, V., Sabino, M.Occurrence of deoxynivalenol in wheat flour, instant noodle and biscuits commercialized in Brazil. Food Addit. Contam. Part B Surveill., 9, 251-255 (2016).

2.Resolução RDC No. 138 de 8 de fevereiro de 2017. Altera a Resolução da Diretoria Colegiada – RDC No.7, de 18 de fevereiro de 2011, que dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos, para alterar os LMT da micotoxina deoxinivalenol (DON) em trigo e produtos de trigo prontos para oferta ao consumidor e os prazos para suaaplicação.

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2017/rdc0138_08_02_2017.pdf

3.Orientação sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, 2011).

4.Vocabulário Internacional de Metrologia, Conceitos fundamentais e gerais de termos associados (Instituto Português da Qualidade, 2012).