生物反应器应用：人间充质干细胞hMSC培养及放大过程工艺关键
2022-11-04 来源:本站 点击次数:2894
人间充质干细胞（hMSCs）在治疗神经、骨骼、关节和心血管等疾病上显示出了良好的发展前景。异源hMSC由于其低免疫排斥性和低制造成本显示出了更大的发展潜力。临床试验中，治疗效果很大程度上取决于给患者输入的合格细胞数量。因此，体外扩增获得足够数量的细胞、降低生产成本，以及扩增系统的持续稳定性将是未来细胞治疗商业化的关键。
工业研究表明，与传统平面扩增方法相比，使用微载体生物反应器培养可以获得近80倍的单位体积细胞产量，同时所占空间更少从而降低了整体制造成本。在生物反应器中微载体悬浮培养具有易于扩展、更均匀的营养分布、可以实现在线/离线监测、可以实施多种补料策略等优势。同时还可以更好地满足FDA对实施过程分析技术（PAT）的建议。
与平面扩增方法不同，微载体培养需要搅拌使培养基均质化，氧气、营养物质和细胞代谢物交换也需依赖传质完成。搅拌还会带来剪切力，也将影响细胞的生长。同时，由于细胞附着微载体主要靠细胞和微载体之间的碰撞和粘附，这一过程也将比平面培养耗时更久。Bioprocessing of Human Mesenchymal Stem Cells: From Planar Culture to Microcarrier-Based Bioreactors中讨论了微载体hMSC扩增中生物反应器的重要过程参数，如温度、pH、DO、搅拌和进料策略，以满足更复杂的生物过程需求。
搅拌
生物反应器搅拌速率保持在所需的速度下限，可以在满足传质需求的条件下避免微载体在死区的聚集。保持微载体悬浮的搅拌速度下限可以通过可视化或粒子图像测速进行确定。找到完全悬浮所有微载体的阈值搅拌，同时要确保微载体均匀分散。
此外在利用微载体进行生物反应器大规模扩增时还需考虑体积能量耗散的影响，即微载体悬浮所需的单位体积功率输入与搅拌速度成正比。搅拌速度常需要随着培养时间的增加而增加，以抵消较重微载体造成的聚集。与混合相关的另一个因素是叶轮尖端速度。由于叶轮尖端剪切应力高，对细胞造成的潜在损害也是较大的。因此，选择合适的叶轮的尺寸和几何形状对可行性至关重要。
适于细胞培养的反应器桨叶控制系统（温度、pH和DO）
hMSC培养适宜温度通常为37°C。生物反应器通常配备有温度控制单元，该温度控制单元接收来自温度传感器的信号。在生物反应器培养中有两种调节温度的方法。一种是保持生物反应器水套的温度；另一种是通过热电偶或温度传感器测量温度来直接控制并使用加热毯或垫加热生物反应器。前者可能由于间接测量而有一些偏差，而后者需要关注温度传感器和热源的相对位置。
高细胞密度的微载体培养需要对pH值进行更精细的控制，这对软件PID控制功能提出了要求。pH设定值通常介于7至7.5之间，可通过稀释碱（例如，NaOH、NaHCO3）和稀释酸（例如，H2SO4）或CO2气体来控制pH值。尽管生物反应器每次使用前必须校准在线pH电极，但结合离线校准可提高细胞增殖期间的测量精度。
D2MS多参数设置与视频流监控软件界面
溶解氧（DO）是维持代谢活动和细胞生长的重要因素。生物反应器供氧有两种方式：底通（sparger)和表通(overlay)。与微生物发酵相比，hMSC培养过程中的溶解氧通常可以通过表通(overlay)曝气来保持。但当细胞密度达到某一临界值，并气液表面与体积比太低，则可以考虑底通（sparger)曝气供氧。
D2MS过程数据监测软件界面
氧传质速率，表示生物反应器中氧传质的效率，由界面面积、传质系数和氧浓度梯度决定。界面面积由几何参数决定，包括生物反应器的形状、尺寸以及喷射气泡的大小决定。气泡尺寸越小，界面面积越大，氧传递越好。氧传质系数受混合、能量耗散等因素的影响。有研究表明，在气流速率为0.05vvm的2-L生物反应器中，将搅拌速度从6 rpm增加到20rpm时，氧传质系数（kLa）增加了1.7倍。
补料策略
培养基是hMSC生产的主要成本之一。采用合理的补料策略，有利于用更少体积的培养基收获更大的细胞产量。分批培养是一种方便且经济的培养策略。其优点有易于操作、低污染风险和更少的培养基用量。但由于营养的限制，分批培养无法实现高细胞密度培养。
更常见的培养策略是分批补料式培养，可以避免营养消耗带来的生长抑制，中途无需停止搅拌，还保留了hMSC分泌的细胞因子，并且在扩增过程中没有细胞丢失。但这种培养策略由于环境改变，可能会导致单位体积细胞产量减少。
灌流培养策略可以稳定地将新鲜培养基添加到生物反应器中，同时将用过的培养基泵出。这种策略可以获得单位培养基体积下更大的细胞密度。有研究在基于微载体的搅拌罐生物反应器中使用相同培养基，用分批补料和灌流培养策略进行培养。灌流培养得到的细胞密度是分批补料的1.28倍。灌注培养补料速率可根据生长和离线培养基分析进行控制，可以以更少的培养基进行补料。
参考文献：Tsai AC, Pacak CA. Bioprocessing of Human Mesenchymal Stem Cells: From Planar Culture to Microcarrier-Based Bioreactors. Bioengineering (Basel). 2021 Jul 7;8(7):96. doi: 10.3390/bioengineering8070096. PMID: 34356203; PMCID: PMC8301102.
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