目前蛋白降解剂研发中PROTAC和分子胶临床进展领先，作用机制相对明确。PROTAC作用机制是“事件驱动”的催化反应，催化靶蛋白降解后，即可释放出来参与下一个蛋白的降解。与传统小分子抑制剂相比，可大幅降低给药浓度。PROTAC即使经过药物代谢在体内清除，细胞仍需要较长时间将靶蛋白恢复到发挥生理作用水平，所以PROTAC有望延长药物作用时间。

GSK公司临床前研究初步展示，一款靶向RIPK2的PROTAC， 血药浓度降到很低时，体内RIPK2蛋白浓度仍维持在较低水平，炎症因子维持较高抑制水平，这可能实现低频次给药。同时，PROTAC在药物浓度优化有“hook effect”。这些因素都导致传统方法不能准确评估PROTAC的PK/PD特性，需建立新的PK/PD评估系统。

建立新PK/PD评估系统需要检测技术准确定量药物浓度和蛋白质降解水平关系，及相关生物标志物变化，从而建立PK/PD作用关系。

实验模型上需要更多研究和设计，在固定给药时间后取样检测药物浓度变化与活性关系，动物水平药物作用后相关信号通路蛋白调节、还有生物标志物选择和检测，要求要有可靠方法检测动物模型的内源性蛋白表达。

目前有多种蛋白质表达检测方法可用于体内实验和临床组织样本研究。液质联用技术，可特异性高灵敏检测组织样本中蛋白质，用于临床前和临床样本，但其缺点是样本前处理复杂，样本需求量大。流式细胞术可检测细胞内和细胞膜蛋白，特别是细胞膜蛋白，对血液中免疫细胞检测有优势，同时进行细胞分类和蛋白定量。免疫组化或免疫荧光技术，主要用于组织蛋白定位和半定量。ELISA技术主要用于检测分泌型细胞因子和趋化因子。Western blot技术可视化看到靶蛋白降解，但传统western只能半定量，手动操作多，重复性差，时间长，样本需要量大，不能很好满足PROTAC体内精确蛋白定量需求。Digital Western作为一种新型的毛细管电泳免疫学检测技术，可满足临床前到临床样本检测需求，实现从临床前到临床方法转移，是新一代蛋白质表达标志物检测技术。

行业领先公司采用Digital Western Blot（也称为Simple Western系统）案例分析

1.  辉瑞公司利用Digital WB分析PROTAC大鼠体内降解组织选择性

辉瑞公司发表在PNAS上文章，主要研究不同linker长度对蛋白降解活性和组织选择性的影响。

• 10只大鼠分5组皮下给药PROTAC 10，药物浓度递增；175mg/kg两次给药。脾脏和肺脏内BTK蛋白浓度变化。B图是原始数据，绝对化学发光数据值变化。

• 尽管不同浓度化合物具有相似组织吸收度和和血浆利用度(D和E), PROTAC 10对大鼠脾脏细胞BTK具有浓度依赖性降解，但对于脏没有，显示出化合物组织选择性；采用质谱蛋白质组量化脾脏和肺中BTK丰度获得相似结果。

• 组织选择性机制可能与BTK或E3连接酶表达、泛素化过程。研究体内控制蛋白降解因素，需要深入理解PK/PD关系。

• 本研究展示开发一种Digital WB技术检测BTK靶蛋白表达方法，可用于细胞系和动物组织样本靶蛋白检测，适用于In vitro到In vivo不同阶段实验需求，方法通用性高。

2.  Digital Western开发多发性骨髓瘤临床样本中蛋白质表达评估，检测63名患者10多种蛋白表达，包括CRBN和IKZF1蛋白表达，分析蛋白质标志物在多发性骨髓瘤患者预后影响，作为预测性生物标志物价值。

3.   Arvinas中枢神经系统疾病Tau-PROTAC体内研究案例

中枢神经系统疾病是PROTAC研究的主要领域，具有多个研发管线在进行。目前神经疾病体内实验经常需要测试脑组织样本，样本具有珍稀特性，以Tau为例，具有多种翻译后修饰，特别是各种磷酸化修饰，导致采用传统Western blot技术具有多个条带，实验条件复杂，很难准确定量，在组织水平检测这些致病蛋白具有更高的挑战。

Arvinas公司建立了针对神经系统疾病一体化研发平台，基于现有致病蛋白研究成果，构建了早期发现平台，利用DEL、AI技术和对E3连接酶理解，开发PROTAC分子。构建了PK/PD体内研究模型，来支持临床转化开发。其Tau-PROTAC项目可区分健康和病理Tau蛋白，具有技术优势。而抗体药物只能阻断细胞外病理Tau，ASO等基因编辑技术，不能区分健康和病理状态Tau蛋白。本项目预期2022年可能临床获批IND。本项目利用Digital Western检测体外细胞水平不溶性Tau蛋白降解水平，同时也检测体内PD/PD实验检测不溶性Tau降解水平。

4.  急性髓系白血病（AML）临床试验样本磷酸化蛋白定量分析

Onvansertib浓度依赖性降低pTCTP表达，在血浆中有抑制活性。部分病人中观察到在循环异常细胞PLK1靶标TCTP参与。骨髓异常细胞减少与PLK1靶标TCTP参与相关，可能作为疗效评估的生物标志物。Digital WB技术满足小分子药物临床样本检测需求，采用洗脱重杂交Replex技术，或者高灵敏双色荧光Western可评估磷酸化蛋白表达，用于PD实验和生物标志物检测。

A和B是患者血浆样本与HL-60细胞共孵育，进行血浆抑制活性实验。Digital WB定量分析血浆样本中pTCTP水平变化；

B图不同Onvansertib药物浓度下pTCTP抑制水平。高浓度时抑制水平增加；

C图是病人PBMC样本TCTP和磷酸化TCTP蛋白表达检测实验。第一天给药前后0h和3h结果，上面target engagement病人（ ≥50% pTCTP 抑制 ），下面是nontarget engagement病人。12，27和40三个剂量不同患者数据；

D图是骨髓异常细胞群相对于基线的百分比变化瀑布图。

Digital Western技术

在PROTAC体内降解实验价值

检测微量珍贵动物组织样本如脑组织或肌肉组织等，实现靶蛋白和细胞信号通路蛋白质标志物定量检测。将在体内PD/PK和药理学实验中发挥重要作用，加快药物研发。

自动化标准化：Digital Western快速获得高质量重复性数据，数据合规，软件符合FDA CFR Part 11要求，可满足临床实验技术要求。已被用于小分子药物临床实验和基因治疗临床试验中蛋白质标志物检测。

技术适用于药物研发临床前和临床不同阶段检测需求，开发一种方法满足不同场景下生物分析需求，从药物发现阶段In vitro细胞水平系实验、到动物体内PK/PD实验、Ex Vivo实验，一直到药物临床试验中病人活检组织样本。

扫描下方二维码获取资料

参考文献

1. Mares, A., Miah, A.H., Smith, I.E.D. et al. Extended pharmacodynamic responses observed upon PROTAC-mediated degradation of RIPK2. Commun Biol 3, 140 (2020).

2. Watt GF, et al. Targeted protein degradation in vivo with Proteolysis Targeting Chimeras: Current status and future considerations, Drug Discov Today: Technol (2019)

3. Derek W. Bartlett and Adam M. Gilbert. Translational PK–PD for targeted protein degradation.Chem. Soc. Rev., 2022,51, 3477

4. Adelajda Zorba, etc. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. PNAS, July 16.2018

5. https://s3.us-east-1.amazonaws.com/arvinas-assets.investeddigital.com/scientific-publications/Angela-Cacace-AAIC-July-2021_2021-08-06-014821_rskj.pdf