2022年11月，北京大学口腔医院国家口腔疾病临床医学研究中心联合首都医科大学附属北京儿童医院在学术期刊上发表题为“Midpalatal Suture: Single-Cell RNA-Seq Reveals Intramembrane Ossification and Piezo2 Chondrogenic Mesenchymal Cell Involvement”的研究成果。文章首次使用单细胞测序深入研究了腭中缝区域，有助于建立腭中缝膜内成骨模型，并揭示了Piezo2⁺成软骨向间充质细胞在骨成熟和重塑过程中的潜在分子特征。
新格元在该研究中承担了组织保存与解离、单细胞转录组(GEXSCOPE^®)测序以及单细胞数据生信分析等工作。
下面和元小新一起来看一下单细胞如何揭示腭中缝膜内成骨模型吧。
 
研究背景
腭中缝是上颌骨宽度生长发育的主要部位，也是对上颌宽度发育不足者进行上颌快速扩弓(RME)过程中阻抗的主要来源部位。探索腭中缝成熟骨化过程，阐明其中的潜在机制，有助于确定腭中缝RME的最佳时机与矫形力大小，临床意义重大。然而，与腭中缝相关的机制研究很少，目前腭中缝成熟骨化过程未见单细胞测序相关研究。

 
思维导图  

研究结果
1.小鼠模型腭中缝的组织学染色和Micro-CT分析
随着周龄的增长，腭中缝的弯曲程度增加，4、5周龄时腭中缝形态较直，9周龄时较为弯曲。此外，从4周龄至9周龄，腭中缝宽度减小，骨密度(BMD)、骨体积/组织体积(BV/TV)明显增加。Micro-CT结果提示，随着腭中缝成熟骨化，其形态更加交错、宽度更窄，骨化程度增加，但需要注意的是，腭中缝在9周龄时仍未融合。组织学染色观察验证了Micro-CT分析结果，腭中缝区主要由纤维细胞、纤维和成骨细胞组成，在4周龄时观察到软骨细胞，但在5和9周龄时很少见。   2.小鼠模型腭中缝的单细胞RNA测序分析
利用单细胞RNA测序分析腭中缝区域的细胞和分子组成，质量控制后获得45,677个细胞，包括来自4周龄小鼠的16,686个细胞、来自5周龄小鼠的17,053个细胞、以及来自9周龄小鼠的11,938个细胞。确定了5种主要的细胞类型，包括上皮细胞、间充质细胞、免疫细胞、内皮细胞、以及神经细胞(图2A)。
由于间充质细胞在成熟骨化过程中，特别是在骨基质形成中作用至关重要，因此，从整体细胞群中选择间充质细胞进行进一步分析。结果表明间充质细胞由5个不同的簇组成，包括周细胞(标志基因为Acta2、Rgs5、Nes)、成骨向间充质细胞(标志基因为Ibsp、Mmp13、Bglap2)、成软骨向间充质细胞(标志基因为Col2a1、Col9a1、Col9a2、Ucma)、成纤维向间充质细胞(标志基因为Smoc2、Col8a1、Dpep1)、以及神经样细胞(标志基因为Olig2、Rtn1、Elavl4)(图2B)。
拟时序与RNA速率分析显示了各簇间充质细胞的分化轨迹，并进一步表明9簇间充质细胞处于不同的状态。在拟时序分析中，周细胞位于上支，成骨向间充质细胞-1(Ost.b1)位于两个下支，成骨向间充质细胞-2 (Ost.b2)和成骨向间充质细胞-3(Ost.b3)位于右下支，成纤维向间充质细胞-1、2、3(Fib.1、Fib.2、Fib.3)位于左下支(图2C)。RNA速率分析表明，虽然3个成骨向间充质细胞簇起始情况不同，但它们向相同的终点分化(图2D)。
    3.不同成骨向间充质细胞簇在腭中缝膜内成骨中的作用
为了描述腭中缝的成骨过程，对成骨向间充质细胞进行了差异表达基因(DEGs)和通路分析。Ost.b1的上调通路与间充质发育和血管生成相关，Ost.b2的上调通路与生物矿化和细胞外基质组织相关，Ost.b3的上调通路与组织重塑、软骨发育和破骨细胞分化相关(图3A、B)。4周龄的成骨向间充质细胞(Ost.b-4w)的上调通路与细胞增殖相关，Ost.b-5w的上调通路与破骨细胞和成骨细胞分化相关，Ost.b-9w的上调通路与软骨内骨形态发生相关(图3C、D)。
进一步分析三个关键时间点各细胞亚簇内成骨向间充质细胞的轨迹。结果表明，Ost.b1主要位于左侧支，Ost.b2主要位于右侧支，Ost.b3分布于左、右分支，这提示每个成骨向间充质细胞亚簇处于不同状态(图3E)。RNA速率分析验证了上述结果(图3F)。 4.Piezo2⁺成软骨向间充质细胞的鉴定
由于软骨细胞在膜内成骨中可能发挥重要作用，因此，研究者进一步分析了腭中缝区成软骨向间充质细胞的数量、百分比与通路富集状态(图4A、B)。这些细胞中上调的通路与软骨凝集、结缔组织发育和机械刺激感受有关。对成软骨向间充质细胞与其他间充质细胞进行差异基因分析，发现了Piezo2基因的差异表达，这是一个与机械感觉离子通道相关的经典标记基因(图4C)。Piezo2基因的pct.1(0.35)与pct.2(0.037)差异较大，表明Piezo2是成软骨向间充质细胞的特异性基因(图4D)。
  5.Piezo2⁺成软骨向间充质细胞可能与感受机械刺激与伤口愈合有关
接下来，研究者进行DEGs与通路富集分析，以明确Piezo2⁺和Piezo2^-成软骨向间充质细胞之间的转录差异(图5A、B)。与Piezo2^-相比，Piezo2⁺成软骨向间充质细胞的机械刺激相关基因(Junb、Fos、lers)表达量更高，并且似乎与伤口愈合、对成纤维细胞生长因子的反应、间充质干细胞和软骨细胞分化等相关(图5C、D)。对Piezo2进行免疫组化染色，验证了Piezo2⁺成软骨向间充质细胞的存在，佐证了上述结果(图5E)。    
结论
为了探索腭中缝成熟骨化过程的潜在机制，本研究建立了一种小鼠腭中缝模型，结合经典的组织学染色分析、Micro-CT分析、以及前沿的单细胞测序分析，明确了腭中缝的细胞与分子组成。本研究首次使用单细胞RNA测序对腭中缝中的细胞群和成骨过程进行了表征，并发现了Piezo2⁺成软骨向间充质细胞群，提示间充质细胞有潜力参与腭中缝的成熟骨化过程。成骨向间充质细胞分为3个簇(Ost.b1、Ost.b2、Ost.b3)，在膜内成骨过程中发挥多种作用。间充质细胞增殖、聚集(Ost.b1)、并分化为成骨细胞(Ost.b1、Ost.b2、Ost.b3)；成骨细胞形成骨化中心，分泌类骨质，诱导骨矿化(Ost.b2)，并转化为骨细胞；骨重建贯穿整个过程(Ost.b3)(图6)。此外，Piezo2⁺成软骨向间充质细胞可能与感受机械刺激有关，并有潜力在腭中缝成骨过程中发挥关键作用。总之，本文对腭中缝成熟骨化过程的研究具有创新性的重要意义。
   
参考文献
Lu Gao, Tiansong Xu , Liqi Zhang，et al. Midpalatal Suture: Single-Cell RNA-Seq Reveals Intramembrane Ossification and Piezo2 Chondrogenic Mesenchymal Cell Involvement.2022 Nov 12;11(22):3585.