将自动化和基础发现融入非传统微生物的设计-构建-测试-学习循环研究
2023-01-30 来源:本站 点击次数:1181
跟踪智慧实验室的理论研究发展状况、产业发展动态、主要设备供应商产品研发动态、国内外智慧实验室建设成果现状等信息内容。本文由中科院上海生命科学信息中心与曼森生物合作供稿。
本期推文编译了 Gurdo N 等发表在 Trends in Biotechnology 期刊上的综述《将自动化和基本发现融入非传统微生物的设计-构建-测试-学习循环》（Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes），该文作者提出了一种“以代谢为中心”的合成生物学设计-构建-测试-学习循环的方法，并得到多组学分析的支持。
目录/CONTENT
01/要点
02/用于生物生产的传统和新兴微生物平台的调查
03/生物铸造厂利用模型微生物宿主推进生物生产
04/生物铸造厂的细胞工厂设计和测试自动化
05/通过自动化和扩展合成生物学工具箱，为基于非传统宿主的细胞工厂铺平道路
06/引入以代谢为中心的分析作为发现平台，指导 DBTL 循环中的工程工作
07/观点总结和未来方向
08/未解决的问题
生物基工业的重大进展使多种化学品的生物生产具有成本效益，但成功的工业过程相对稀缺，并且仅限于使用少数主力微生物作为宿主。深入了解非传统微生物的生理学和代谢是释放其生物技术潜力的关键。生物铸造厂的诞生使构建和测试大量为生物生产量身定制的微生物菌株的能力成倍增加——作者认为其中的自动化工作流程可以适应获得非传统宿主的基本知识。在这里，作者提出了一种“以代谢为中心”的合成生物学设计-构建-测试-学习循环的方法，并得到多组学分析的支持。
01
要点
由于合成生物学工具集和基础知识有限，用于生物生产的非传统宿主仍未得到充分开发。多组学方法能够对微生物代谢进行系统级理解——将工程工作作为设计-构建-测试-学习 (DBTL：design–build–test–learn) 循环的基本要素来指导。生物铸造厂能够在创纪录的时间内生成和测试数百种微生物菌株——但对常见和非传统宿主代谢特征的探索并未完全纳入管道。自动化在合成生物学和代谢工程中发挥着核心作用，除了减少工作流程时间外，还可以用作指导工程工作的发现工具。DBTL 循环中以代谢为中心的观点有望加速细胞工厂组装工作流程，同时提供有关基本生物学问题的关键信息。
02
用于生物生产的传统和新兴微生物平台的调查
可持续化学生产在不断发展的生物基行业中占据了稳固的地位，以替代目前几乎完全来自化石资源的产品。生物底盘是使用代谢工程工具定制的，该工具产生多功能生物生产平台（即细胞工厂），用于合成广泛的大宗和精细化学品——支持更可持续、更绿色的社会。尽管对高价值（生物）产品的需求不断增长，继续以前所未有的速度加速细胞工厂的发展，但为生物生产创建强大的微生物平台是一项相对手工且耗时的工作。此外，难以合成的化合物——无论是由于其毒性还是因为它们是新的自然物质，没有可用于合成的天然生物催化剂，仍在等待大规模生产。实现这一目的的工程细胞工厂需要一个多步骤的设计和执行策略，从生化网络的计算机模拟到与规模相关的生物反应器中所需代谢物的实际生物生产。整个过程所需的时间跨度取决于几个方面；首先，用于选定宿主基因组工程的遗传元件（即部分）的可用性和可及性；其次，评估包含实验室规模生物生产所需修改的初始原型；最后，优化不同的参数以增加滴度并最大化目标化合物的通量以及生物工艺放大。在满足与工业规模生物生产兼容的关键性能参数 之前，此序列的迭代对于提高工程底盘的性能是必要的。
革兰氏阴性细菌大肠杆菌和酵母酿酒酵母是常规用于构建细胞工厂的常规底盘。对其生理学和遗传学的深入了解，以及广泛的遗传工具的可用性，使这些微生物在争取最佳生物生产平台的竞赛中处于领先地位。许多例子展示了如何对大肠杆菌进行工程改造以产生大量化合物，例如生物燃料、大宗化学品、天然产物和聚羟基链烷酸酯。同样，酵母细胞工厂进一步扩展了可从可再生基质生产的目标化学品组合。工程酿酒酵母生产的多种生物基化学品（例如有机酸和脂肪酸、生物燃料、类异戊二烯、芳烃和聚酮）说明了这一点。大多数这些细胞工厂的工业相关性仅限于原理验证尝试——除了重组蛋白生产和一些大宗化学品的生物合成。大规模发酵中的高产品滴度和稳健性，对于工业应用同样必要，但在此类试点研究中很少成功实现。这些性能指标与宿主的新陈代谢和生理学密切相关，这使得稳定生产参数等性状难以设计。例如，大肠杆菌对底物和氧气梯度的敏感性，由于混合限制，在大型生物反应器中经常遇到，是一个长期存在的问题，只是部分解决了。同样，大肠杆菌和酵母的溢出代谢规定了仅限于低底物浓度的糖喂养政策，并放大了与底物梯度相关的问题。因此，具有独特或额外优势特性的非传统宿主成为替代微生物候选者，因为它们在生产特定化合物方面表现出增强的性能，或者因为它们可以抵抗工业规模生产中典型的恶劣条件。此外，非传统宿主能够使用替代原料，例如 C1 化合物作为 CO2，规避与其他工业过程和食品生产的竞争。在许多其他有希望的微生物中，细菌种类天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和红球菌属，以及真核生物曲霉属和 Rhodotorula toruloides 属于非传统生物生产平台的广泛类别。（表格1）说明了这些微生物的一些关键特征，例如，它们产生特定类型分子的能力、对有毒化合物和极端培养条件的耐受性、遗传工具的可用性、底物范围和快速生长速度。这些物种已经找到了以生物技术生产大宗和精细化学品的方式，无论是代谢工程菌株的形式，还是通过长期选择性培养计划获得的过度生产变体的形式。这种类型的另一个突出例子是革兰氏阴性细菌恶臭假单胞菌，这都是由于合成生物学工具的可用性——不断扩大——以及对化学和氧化应激的显著耐受性。然而，这些微生物在代谢工程和工业应用方面仍未得到充分利用，因为在基因型与表型关系及其代谢网络结构方面存在显著的知识差距。扩大对微生物代谢的了解对于扩大可以“驯化”为细胞工厂的微生物底物的种类是必不可少的。在大多数非传统微生物中，关于 DNA 修饰如何影响表型或代谢网络如何在几个调节水平上相互作用的问题仍然不清楚。了解基因型与表型之间的关系需要充分利用合成生物学工具，实现合理和靶向的 DNA 修饰，以及全面探索代谢的动态行为，将物理化学或生化扰动与表型变化联系起 来。目前，解决这些挑战的大多数努力都集中在开发新的工具来设计非模型微生物。同时，微生物原型的深入多组学分析正在为模型生物提供动力，允许以前所未有的细节探索细胞中的多个调控层。尽管这些策略是必要的，但它们通常不足以调查非传统微生物作为生物生产平台的潜力——在这种平台上，缺乏对整个生物实体的系统理解。因此，合理设计、多组分数据集成、预测模型和自动化的智能组合对于构建高效的细胞工厂、扩展基础知识和指导代谢工程至关重要。
03
生物铸造厂利用模型微生物宿主推进生物生产
设计、建造和测试电池工厂在工作量、时间和成本方面都很苛刻。这些活动中的大多数仍以（半）手工的方式沿着被称为合成生物学设计-构建-测试-学习（DBTL）循环的迭代工作流程进行。生物铸造厂的出现旨在加速和自动化这一序列，同时提高一致性、通量和降低劳动力成本。因此，生物铸造厂的主要目标是简化化学生产的微生物底盘工程。然而，生物铸造管道的最终产品，即细胞工厂，只是一个工业级生物生产平台的起点。一个整合的生物过程绝不是在那个阶段完成的，而且在升级阶段必须投入大量的时间和成本，这通常涉及到重新设计或升级细胞工厂的某些功能，或者选择完全不同的微生物宿主。幸运的是，合成生物学和多组学方法学的最新进展为加强生物铸造厂的作用提供了强有力的框架。在这个结构中，作者提出了 DBTL 循环的升级版本，其中“以代谢为中心” 的观点——而不是更传统的以基因组为中心的方法——有助于揭示生物技术相关微生物的表型复杂性。在这里，作者将生物铸造厂作为一个自动化平台来扩展对非传统微生物的知识——以及如何利用这些信息来定制强大的细胞工厂。作者还概述了快速构建主流宿主和替代宿主的多种突变变体的最新工具箱发展，重点是下一代宿主 P. putida。在这种情况下，生物铸造厂被提议作为一个功能接口，在该接口中，组学技术的集成使得几乎任何微生物底盘都能得到合理的操纵—— 新陈代谢是这种发展的核心驱动力——从而实现细胞工厂的全自动化部署。
04
生物铸造厂的细胞工厂设计和测试自动化
自动化技术正日益融入合成生物学和代谢工程。通常，构建一个含有相对简单的合成代谢途径的细胞工厂需要至少十个单独的 DNA 模块。这些遗传部分必须以多种配置进行重新排列，以产生以合理滴度产生所需产物的变体——这使得人工构建 DNA 组装既不切实际又耗时。相比之下，自动化为细胞工厂设计和建造提供了高效、标准化的解决方案。一个主要的挑战是以快速有效的方式测试植入给定宿主的基因构建体的大组合，同时了解每个修饰对最终表型的生物学意义。生物铸造厂拥有在由机器人液体处理器控制的集成分子生物学设施中处理大量遗传构建体的能力，结合高通量分析并由专用软件支持。DNA 构建体快速原型的生物铸造简化方案如图1A所示。学术生物铸造厂的一个值得注意的方面是，整个工作流程仍然没有完全自动化或在 DBTL 周期的所有级别进行集成。细胞 工厂建设中的中间步骤需要广泛的优化，大部分在平台外手动（至少部分）执行。此外，到目前为止，自动化在提供关于新陈代谢的深刻基础信息方面的能力还没 有得到充分利用。
图1.自动化生物铸造厂微生物生理学和代谢的基本发现。（A） 微生物原型自动化平台的总体方案。机器人液体处理器组件根据其功能以不同的颜色或位置显示。该平台包括 PCR 机（黄色）、电穿孔站（浅蓝色）、培养装置（绿色）、 分光光度计（浅红色）、搬运机械臂（顶部）、尖端盒（白色）和快速过滤装置（右侧，浅橙色）。所有这些组件都放在一个化学罩中。（B）通过快速质粒构建、转化、质粒纯化、治愈和基因分型介导的自动基因组工程。流水线中的不同步骤如下：（i）通过 PCR 从标准零件（标准欧洲载体结构，SEVA）进行遗传零件组装；（ii）将 PCR 产物转化为化学活性大肠杆菌，随后进行测序确认；（iii）质粒 DNA 纯化和转化为非传统目的宿主；和（iv）单个克隆的质粒固化和基因型检查。整个过程原则上可以在4-5 天内完成，并在基本上任何革兰氏阴性细菌宿主上产生菌株变体库。缩写：OD，光密度；PCR、聚合酶链反应。
传统微生物宿主（主要是大肠杆菌）的正向工程在 DBTL 循环的设计-构建阶段利用了生物铸造厂的潜力。最近的两个例子说明了工程大肠杆菌用于（2S）-黄烷酮和十二醇生物生产的半自动化方法。第一个例子是通过在自动化管道中组装表达构建体的组合文库来优化不同类黄酮的生物合成过程。基因部分被设计为通过连接酶循环反应与 DNA 组装完全兼容，并通过液体处理机器人平台执行计算机移液工作流程。应用这种半自动 DBTL 程序，以甘油为原料，获得了高滴度的柚皮素（484 mg/l）、松脂素（198 mg/l），高滴度（55 mg/l，以咖啡酸酯为原 料）和后莫圣草素（17 mg/l）。在第二个例子中，使用基因库和核糖体结合位点 （RBS）系统地操纵基因表达强度，用于十二醇生物生产。通过测试来自大肠杆菌 MG1655 的 60 株工程菌株，实施了两个连续的 DBTL 循环以增强葡萄糖的产物形成。在第一次迭代中，通过采用一组预测强度不同的 RBS 来调节不同酰基 载体蛋白（ACPs）/酰基辅酶 A（CoA）还原酶基因的表达。硫酯酶和酰基辅酶 A 合成酶基因同样被纳入这些设计中。接下来，将这些实验中产生的蛋白质浓度和产品产量数据输入机器学习算法，以预测进一步的优化步骤。基于计算机预测 的第二次迭代使十二醇滴度（0.83±0.13 g/l）比第一次循环的基础菌株提高了21%。重要的是，Opgenorth 及其同事的研究在实现机器学习算法提出的设计时暴露了缺点。挑战包括（i）可用RBS对蛋白质含量的可预测性有限，（ii）途径 蛋白的非靶向效应（例如 FadD 酰基-辅酶 A 合成酶的表观毒性），（iii）通过改变 单个 RBS（例如极性）带来的整体操纵子效应，（iv）当使用密切相关（与完全 组合相反）构造的训练集时，掩盖整个数据空间中的局部趋势，以及（iv）需要大数据集来可靠地训练机器学习路径。
最近的另一项研究描述了一种半自动管道，用于优化酿酒酵母工程菌株生产白桦酸（一种五环三萜）。作者应用了 SCRaMbLE，这是一种体内诱导的合成染色体缺失系统，目的是生成多样化的菌株库。白桦酸途径模块的设计和构建阶段 是手动进行的，而测试部分是通过实施自动化高通量筛选方法来执行的。因此， 该文描述了使用酵母细胞工厂的全自动化生物生产过程的最接近的例子之一，有可能包含实现完全自动化的额外步骤。另一种真菌物种假土曲霉（Aspergillus pseudoterus）已进行了深入的、多组学指导的工程，用于聚合物前体 3-羟基丙酸 （3-HPA）的糖依赖性生物合成——在生物反应器培养物中，滴度可达 0.88±0.11 g/l。该方法基于蛋白质组学和代谢组学，鉴定能够从预期的 3-HPA 合成途径排出通量的上调蛋白。建立了合成β-丙氨酸依赖的产物形成途径，并通过删除负责 3-HPA 降解的丙二酸半醛脱氢酶基因（Apald6）重新定向乙酰辅酶 A 通量。
这个章节的讨论提供了自动化潜力的原理示例。这些开创性的研究还揭示了一个事实，即大体上，模式生物是首选的生物铸造宿主。只有将细菌宿主的种类大大扩展到大肠杆菌之外，特别是生产非普通化学品，生物铸造厂的全部潜力才能实现。这项工作需要一个自动化的管道来实现非模型生物的合成工具集，同时需要组学驱动的对其代谢和生理学基础知识的扩展。下一节将讨论生物铸造厂如何成为这方面的关键参与者。
05
通过自动化和扩展合成生物学工具箱为基于非传统宿主的细胞工厂铺平道路
体内 DNA 模块的构建和组装以及从头途径设计是细胞工厂开发的重要组成部分。将这些技术推广到非传统宿主可以标志着从缓慢驯化到合理设计的转变， 克服复杂代谢网络和有限的微生物生理学知识带来的障碍。由于物种间的功能不相容性（例如，RecA 介导的重组较差），为生物技术主流的基因工程建立的方法很难转移到非模型宿主。最近为非模式生物量身定制了一些尖端技术，但仍有很大的改进空间——尤其是在准确表征这些替代宿主中的工具方面。将非传统微生物整合到生物铸造管道中，不仅可以开发出新的（潜在的，更高级的）细胞工厂， 而且还将刺激对这些宿主的基础研究。生物铸造厂可以生产大量的表型和组学数据，如果这些数据被广泛提供给科学界，将成为学术界和工业界研究的指导资源。对新分离的微生物及其工具箱进行表征，这项过去需要几十年的努力，现在可以简化并以很小的时间和成本进行。稍后将讨论假单胞菌的基因组工程，以说明生物铸造厂在实现这些目标方面可能发挥的作用。
工具箱优化和大规模复用是 DBTL 周期构建阶段的两个重要方面，以释放非传统主机作为单元工厂的潜力。假单胞菌基因组工程已经针对手动工作流程进 行了优化，但它可以进一步发展为自动化设置。到目前为止，最快的恶臭假单胞菌基因缺失方案需要将自杀质粒共整合到感兴趣的位点中。整合位点和要切除的区域由自杀质粒中两个同源臂（HA）的序列决定；用户可以自由选择这些臂来介导细菌染色体中几乎任何位置的同源重组（HR）事件。通过在 HA 中加入遗传元素，这些特征同样可以整合到目标基因座中。通过从辅助质粒表达基因而反 式提供的 I-SceI 归巢巨核酸酶引入双链 DNA 断裂，从而迫使第二个 HR 事件从基因组中移除质粒骨架和靶区。通过将质粒复制的合成控制纳入所谓的 pQURE 质粒工具集，这一策略得到了升级，通过向培养基中添加 3-甲基苯甲酸盐，可以 严格控制质粒的繁殖。然而，这些方法的潜力有待充分挖掘。例如，自动化可以用于在几轮迭代中生成大型构造库。为此，可以采用克隆标准，例如标准欧洲向量架构（SEVA），以模块化方式组装复杂回路，从而产生与许多革兰氏阴性宿主兼容的广泛宿主范围构建体，同时促进遗传部分的可重用性。在这里，作者提出了一个通过自动化和并行化相结合的非传统革兰氏阴性菌快速基因组工程的原型工作流（图1B）。该工作流程包括（i）遵循标准的模块化 DNA 部分的平行和自动组装、（ii）用组装的构建体对大肠杆菌进行电转化，（iii）高通量纯化质粒 DNA 并用质粒文库转化所需宿主，随后（iv）用自固化 pQURE 载体转化并对所得无质粒菌株变体进行基因分型。该工作流程中的所有步骤都可以通过集成在机器人平台中的自动液体处理器轻松控制。
虽然已知该工作流程中提到的所有技术都可单独应用于 P.putida，但需要对其他宿主中的功能元件和部件（例如抗生素标记、基因表达系统、HR 机制和效率、转化方案和反选择标记）进行快速和自动原型设计，以验证其性能。可使用广泛使用的技术（例如，USER 克隆、Golden Gate 克隆、Gibson 组装或 SureVector） 组装此类管道中使用的质粒，并且根据所选择的方法，自动化协议最近已经可用。按照标准化的克隆策略，一旦创建了大多数部分，就可以重新用于多种构建体——例如质粒主干。鉴于整合质粒中作为 HA 所需的特定 PCR 扩增子大小相等（约 500 bp），而不考虑靶点，这些 HA 可以以高通量方式获得，例如 96 孔板（图 1B 中的步骤 1）。对于许多克隆策略，DNA 片段的组装可以在相同的布局中进行， 甚至无需事先纯化。一旦质粒组装好，它们就以 96 孔电穿孔板形式转入大肠杆菌进行繁殖（图 1B 中的步骤 2）。通过克隆 PCR 和 Sanger 测序验证质粒的正确 性。再次，使用标准化引物集进行验证，这样这一步骤也可以自动化。由于 Sanger 测序价格合理，克隆效率通常很高，这种方法既具有经济竞争力，又快速，因为不需要 DNA 纯化或凝胶电泳，从而实现高通量。图1B 中的步骤 3 说明了使用 市售 DNA 提取试剂盒以 96 孔板形式纯化质粒。然后通过电穿孔、化学转化或缀合将纯化的质粒引入感兴趣的（非传统）宿主中，回收后，将细胞接种到选择性培养基上以选择亚倍体。请注意，将细菌悬浮液分散到选择性琼脂平板上以分离单个菌落是序列中的关键步骤，但基本上没有实现这一目的的全自动化、高效的方案。该方案的最后一部分（图 1B 中的步骤 4）涉及通过在亚二倍体克隆中引入 pQURE 系统来强制第二次HR事件，然后进行质粒固化。可以使用阴性选择标记（例如，sacB）来促进质粒消除，从而实现更高的产量。序列的最后一步是通过克隆 PCR 和 Sanger 测序进行基因型确认，如质粒构建阶段所示。此时， 菌株库已准备好进入测试阶段，即多组学方法促进的代谢网络分析。
06
引入以代谢为中心的分析作为发现平台，指导 DBTL 循环中的工程工作
采用非模式生物作为底盘的主要挑战不仅是基因工程工具的相对缺乏—— 这可以通过实施上一节中建议的管道部分解决——而且关于代谢结构及其调控的信息有限。因此，需要对不同环境条件下的代谢进行详细分析，例如遗传或化学干扰，以了解代谢结构和调节。反过来，这些信息可以用于确定与生物技术相关的可行代谢景观。与自动化和合成生物学协同提高细胞工厂建设的速度和产量一样，自动化与多组学分析相结合可以扩展对代谢网络的知识。在计算数据集成的支持下，用于系统生物学目的的多组学已经取得了重大进展，这允许全面理解跨多组学层的代谢网络。多种检测和测量技术可用于捕获基因型-表型之间的信息，包括 DNA 和 RNA 测序（即基因组学和转录组学）、基于质谱（MS）的代谢组学、蛋白质组学和通量组学以及核磁共振。图 2 以加速基因组工程、多组学分析和自动化相结合的中心思想为基础，为 DBTL 循环提供支持，同时解决微生物代谢的基本问题。
图 2.以代谢为中心的合成生物学设计-构建-测试-学习循环方法，由深度多组学分析支持。该图从左至右描绘了在快速基因组工程、多组学分析和自动化支持下，在探索非传统宿主代谢结构的基本方面时指导工程步骤的一般策略。
这种类型的多组学分析体现在代谢中心观点在不同微生物中的一些应用中。不足为奇的是，其中两个例子中采用了一种因其多功能和复杂的代谢而被广泛认可的非传统宿主——P.putida。该文讨论的实例包含了对（i）δ-戊内酰胺（哌啶 -2-酮）作为唯一碳源的利用和ε-己内酰胺（氮杂环己内酰胺）的分解代谢，以 及（ii）复杂的脂肪酸和酒精代谢的多组学探索。在第一个例子中，作者通过使用随机条形码转座子测序（RB-TnSeq）和鸟枪蛋白质组学的组合来研究δ-戊内酰胺分解代谢，以提高内酰胺滴度。一个特定位点（oplBA）被鉴定为编码负责启动δ-戊内酰胺分解的功能。接下来，删除 oplBA 基因以防止δ-戊内酰胺在富培养基中降解，这也减少了ε-己内酰胺的消耗。然后，使用关键代谢前体（即 L-赖氨酸或5-氨基戊酸）的途径也被删除，使得δ-戊内酰胺滴度从检测不到的显著增加到约 90 mg/L。在第二个例子中，RB-TnSeq 技术被用于为参与脂肪酸和酒精分解代谢的酶分配功能迄今其作用原理未知。通过序列同源性将功能分配给孤儿酶可能极具挑战性，因为许多假定的旁系基因编码相似的活性，可以共存，同时显示不同的调控模式。在这种情况下，在对不同脂肪酸和醇作为唯一碳源的转座子文库进行深度适应度分析后，强表型可追溯到数百个基因。根据在不同链长的脂肪酸上培养突变体池的实验数据推断酶底物偏好。一个特定的蛋白质家族，称为 DUF1302/DUF1329，被假设起酯酶的作用。此外，还发现了异戊醇（3-甲基丁烯-3-烯-1-醇，一种半萜醇）和异戊醇（3-乙基丁-1-醇）分解代谢的新途径。这些醇被提议在初始氧化步骤和通过 CoA 连接活化后通过 L-亮氨酸代谢分解。由于脂肪酸和醇都是生产重要生物产品的关键前体，这项研究的结果必将指导未来的菌株设计。
细胞工厂构建过程中的代谢中心观点也体现在腔色链球菌产生聚酮抗生素放线素的过程中。在这里，基于代谢组学和转录组学的分析表明，环腺苷酸 （cAMP）浓度与放线素生物合成密切相关，这似乎是一种调节性、多效性效应， 而不是直接的前体喂养。这一初步迹象导致作者在培养基中补充 cAMP。随后的多组学分析表明，补充 cAMP 后，鸟嘌呤浓度增加。通过使用胍类似物7-甲基鸟 嘌呤抑制了胍依赖性反应，这排除了 cAMP 的积极作用，表明同源反应介导了细菌生长和抗生素生产的积极作用。
最后，通过自动化将细胞工厂建设推向下一个水平的以代谢为中心的方法可 以依赖于将细菌生长与感兴趣分子的生物合成耦合，或将最终促进生物质形成的多个代谢模块耦合。携带生长耦合模块的菌株可以通过适应性实验室进化（ALE）进化，以改进表型丰富种群。这种方法将显著减少筛选时间，因为识别高产量变体的参数是细菌生长。这种策略在构建细胞工厂以生物合成难以生产的化合物时尤其有用，例如卤化分子，这些化合物需要大量的分析工作来检测和定量。
07
观点总结和未来方向
生物铸造厂是在生物工业的框架内出现的，以加速细胞工厂的发展。优化工作流程，为可持续化工生产建立高性能、工业级微生物平台，是现有生物铸造厂的座右铭，无论是在工业界还是学术界。然而，利用生物铸造厂的生产能力和概念框架 来获得微生物生理学和代谢的基本知识，进而将这些信息反馈到工作流程中，以支持细胞工厂设计，这一潜力尚未得到开发。同样，重新编程也为进一步深入了解生命系统的复杂性提供了基础性的见解，为后续的工程设计提供了动力。这一概念将有助于为生物技术和生物医学重新编程细胞建立通用（而非生物特定）生物设计规则。
自动化是这些发展的关键，但并非没有挑战。为了使整个实验室工作流程自动化，管道中实施的协议必须一致，提供精确的量化并确保再现性。尽管支持技术越来越可靠，但仍有很大的改进空间，因为在系统或多或少独立运行之前，实现自动化例程仍然需要耗时的优化。与这些努力相结合，多元组学分析也带来了一些障碍。很明显，过去的学习在目标分子和微生物宿主之间并没有很好地传递， 而且实验数据集的质量、数量和一致性往往不足，无法从中学习，即使是大肠杆菌或酵母。因此，数据管理至关重要，因为深度和高通量分析会产生大量数据集。由于这些不一致性，多组分数据集成相当具有挑战性，在开放获取环境中跨生物铸造厂的数据比较将至关重要。幸运的是，已经建立了一些计算工具以及统计工具箱来支持这些发展。如上述的一些示例所示，由于机器学习的预测能力，它也成为合成生物学的坚实支柱。
作者认为，为该文所述目的调整生物铸造厂可以以相对简单的方式完成。在持续的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）大流行期间，生物铸造厂的多功能性已成为一个明显的例子，因为卫生危机暴露了创新和快速适应的生物技术方法对抵消其影响的重要性。迅速调整现有科学基础设施和劳动力的用途， 从而开发出安全有效的候选疫苗。按照同样的推理，可以预期，重新启动生物铸造厂以支持基本发现将扩大对非传统微生物固有代谢复杂性的现有理解。因此， 在 DBTL循环中应用以代谢为中心的层将在未来通过生物合成途径获得化学物质来升级工业生物技术，而到目前为止，这些化学物质已超出常用细胞工厂的生物学范围。尽管仍有一些挑战有待解决（见未决问题），但该文中提出的一些解决方案可能有助于在急需替代石油生产（受到各种政治和经济影响）的时候巩固生物经济。
08
未解决的问题
非传统宿主中复杂（和有利）细胞性状的生化和遗传基础是什么？
合成生物学能否实现这些特性的正向工程？
生物铸造厂会根据预期应用以及大量的底盘集来选择最合适的宿主吗？
自动化是否可以通过便利通常耗时的协议来推动处理代谢工程的方式的革命？
这些以代谢为中心的自动化序列在多大程度上有助于在实际工业规模上部署非传统细胞工厂？
全文完
参考文献：Gurdo N, Volke DC, Nikel PI. Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes. Trends in Biotechnology. 2022;40(10):1148-59.
Mediacenter Editor | 曼森编辑
文章来源：本文由中科院上海生命科学信息中心与曼森生物合作供稿
排版校对：刘娟娟编辑
内容审核：郝玉有博士
本期推文编译了 Gurdo N 等发表在 Trends in Biotechnology 期刊上的综述《将自动化和基本发现融入非传统微生物的设计-构建-测试-学习循环》（Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes），该文作者提出了一种“以代谢为中心”的合成生物学设计-构建-测试-学习循环的方法，并得到多组学分析的支持。
目录/CONTENT
01/要点
02/用于生物生产的传统和新兴微生物平台的调查
03/生物铸造厂利用模型微生物宿主推进生物生产
04/生物铸造厂的细胞工厂设计和测试自动化
05/通过自动化和扩展合成生物学工具箱，为基于非传统宿主的细胞工厂铺平道路
06/引入以代谢为中心的分析作为发现平台，指导 DBTL 循环中的工程工作
07/观点总结和未来方向
08/未解决的问题
生物基工业的重大进展使多种化学品的生物生产具有成本效益，但成功的工业过程相对稀缺，并且仅限于使用少数主力微生物作为宿主。深入了解非传统微生物的生理学和代谢是释放其生物技术潜力的关键。生物铸造厂的诞生使构建和测试大量为生物生产量身定制的微生物菌株的能力成倍增加——作者认为其中的自动化工作流程可以适应获得非传统宿主的基本知识。在这里，作者提出了一种“以代谢为中心”的合成生物学设计-构建-测试-学习循环的方法，并得到多组学分析的支持。
01
要点
由于合成生物学工具集和基础知识有限，用于生物生产的非传统宿主仍未得到充分开发。多组学方法能够对微生物代谢进行系统级理解——将工程工作作为设计-构建-测试-学习 (DBTL：design–build–test–learn) 循环的基本要素来指导。生物铸造厂能够在创纪录的时间内生成和测试数百种微生物菌株——但对常见和非传统宿主代谢特征的探索并未完全纳入管道。自动化在合成生物学和代谢工程中发挥着核心作用，除了减少工作流程时间外，还可以用作指导工程工作的发现工具。DBTL 循环中以代谢为中心的观点有望加速细胞工厂组装工作流程，同时提供有关基本生物学问题的关键信息。
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用于生物生产的传统和新兴微生物平台的调查
可持续化学生产在不断发展的生物基行业中占据了稳固的地位，以替代目前几乎完全来自化石资源的产品。生物底盘是使用代谢工程工具定制的，该工具产生多功能生物生产平台（即细胞工厂），用于合成广泛的大宗和精细化学品——支持更可持续、更绿色的社会。尽管对高价值（生物）产品的需求不断增长，继续以前所未有的速度加速细胞工厂的发展，但为生物生产创建强大的微生物平台是一项相对手工且耗时的工作。此外，难以合成的化合物——无论是由于其毒性还是因为它们是新的自然物质，没有可用于合成的天然生物催化剂，仍在等待大规模生产。实现这一目的的工程细胞工厂需要一个多步骤的设计和执行策略，从生化网络的计算机模拟到与规模相关的生物反应器中所需代谢物的实际生物生产。整个过程所需的时间跨度取决于几个方面；首先，用于选定宿主基因组工程的遗传元件（即部分）的可用性和可及性；其次，评估包含实验室规模生物生产所需修改的初始原型；最后，优化不同的参数以增加滴度并最大化目标化合物的通量以及生物工艺放大。在满足与工业规模生物生产兼容的关键性能参数 之前，此序列的迭代对于提高工程底盘的性能是必要的。
革兰氏阴性细菌大肠杆菌和酵母酿酒酵母是常规用于构建细胞工厂的常规底盘。对其生理学和遗传学的深入了解，以及广泛的遗传工具的可用性，使这些微生物在争取最佳生物生产平台的竞赛中处于领先地位。许多例子展示了如何对大肠杆菌进行工程改造以产生大量化合物，例如生物燃料、大宗化学品、天然产物和聚羟基链烷酸酯。同样，酵母细胞工厂进一步扩展了可从可再生基质生产的目标化学品组合。工程酿酒酵母生产的多种生物基化学品（例如有机酸和脂肪酸、生物燃料、类异戊二烯、芳烃和聚酮）说明了这一点。大多数这些细胞工厂的工业相关性仅限于原理验证尝试——除了重组蛋白生产和一些大宗化学品的生物合成。大规模发酵中的高产品滴度和稳健性，对于工业应用同样必要，但在此类试点研究中很少成功实现。这些性能指标与宿主的新陈代谢和生理学密切相关，这使得稳定生产参数等性状难以设计。例如，大肠杆菌对底物和氧气梯度的敏感性，由于混合限制，在大型生物反应器中经常遇到，是一个长期存在的问题，只是部分解决了。同样，大肠杆菌和酵母的溢出代谢规定了仅限于低底物浓度的糖喂养政策，并放大了与底物梯度相关的问题。因此，具有独特或额外优势特性的非传统宿主成为替代微生物候选者，因为它们在生产特定化合物方面表现出增强的性能，或者因为它们可以抵抗工业规模生产中典型的恶劣条件。此外，非传统宿主能够使用替代原料，例如 C1 化合物作为 CO2，规避与其他工业过程和食品生产的竞争。在许多其他有希望的微生物中，细菌种类天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和红球菌属，以及真核生物曲霉属和 Rhodotorula toruloides 属于非传统生物生产平台的广泛类别。（表格1）说明了这些微生物的一些关键特征，例如，它们产生特定类型分子的能力、对有毒化合物和极端培养条件的耐受性、遗传工具的可用性、底物范围和快速生长速度。这些物种已经找到了以生物技术生产大宗和精细化学品的方式，无论是代谢工程菌株的形式，还是通过长期选择性培养计划获得的过度生产变体的形式。这种类型的另一个突出例子是革兰氏阴性细菌恶臭假单胞菌，这都是由于合成生物学工具的可用性——不断扩大——以及对化学和氧化应激的显著耐受性。然而，这些微生物在代谢工程和工业应用方面仍未得到充分利用，因为在基因型与表型关系及其代谢网络结构方面存在显著的知识差距。扩大对微生物代谢的了解对于扩大可以“驯化”为细胞工厂的微生物底物的种类是必不可少的。在大多数非传统微生物中，关于 DNA 修饰如何影响表型或代谢网络如何在几个调节水平上相互作用的问题仍然不清楚。了解基因型与表型之间的关系需要充分利用合成生物学工具，实现合理和靶向的 DNA 修饰，以及全面探索代谢的动态行为，将物理化学或生化扰动与表型变化联系起 来。目前，解决这些挑战的大多数努力都集中在开发新的工具来设计非模型微生物。同时，微生物原型的深入多组学分析正在为模型生物提供动力，允许以前所未有的细节探索细胞中的多个调控层。尽管这些策略是必要的，但它们通常不足以调查非传统微生物作为生物生产平台的潜力——在这种平台上，缺乏对整个生物实体的系统理解。因此，合理设计、多组分数据集成、预测模型和自动化的智能组合对于构建高效的细胞工厂、扩展基础知识和指导代谢工程至关重要。
03
生物铸造厂利用模型微生物宿主推进生物生产
设计、建造和测试电池工厂在工作量、时间和成本方面都很苛刻。这些活动中的大多数仍以（半）手工的方式沿着被称为合成生物学设计-构建-测试-学习（DBTL）循环的迭代工作流程进行。生物铸造厂的出现旨在加速和自动化这一序列，同时提高一致性、通量和降低劳动力成本。因此，生物铸造厂的主要目标是简化化学生产的微生物底盘工程。然而，生物铸造管道的最终产品，即细胞工厂，只是一个工业级生物生产平台的起点。一个整合的生物过程绝不是在那个阶段完成的，而且在升级阶段必须投入大量的时间和成本，这通常涉及到重新设计或升级细胞工厂的某些功能，或者选择完全不同的微生物宿主。幸运的是，合成生物学和多组学方法学的最新进展为加强生物铸造厂的作用提供了强有力的框架。在这个结构中，作者提出了 DBTL 循环的升级版本，其中“以代谢为中心” 的观点——而不是更传统的以基因组为中心的方法——有助于揭示生物技术相关微生物的表型复杂性。在这里，作者将生物铸造厂作为一个自动化平台来扩展对非传统微生物的知识——以及如何利用这些信息来定制强大的细胞工厂。作者还概述了快速构建主流宿主和替代宿主的多种突变变体的最新工具箱发展，重点是下一代宿主 P. putida。在这种情况下，生物铸造厂被提议作为一个功能接口，在该接口中，组学技术的集成使得几乎任何微生物底盘都能得到合理的操纵—— 新陈代谢是这种发展的核心驱动力——从而实现细胞工厂的全自动化部署。
04
生物铸造厂的细胞工厂设计和测试自动化
自动化技术正日益融入合成生物学和代谢工程。通常，构建一个含有相对简单的合成代谢途径的细胞工厂需要至少十个单独的 DNA 模块。这些遗传部分必须以多种配置进行重新排列，以产生以合理滴度产生所需产物的变体——这使得人工构建 DNA 组装既不切实际又耗时。相比之下，自动化为细胞工厂设计和建造提供了高效、标准化的解决方案。一个主要的挑战是以快速有效的方式测试植入给定宿主的基因构建体的大组合，同时了解每个修饰对最终表型的生物学意义。生物铸造厂拥有在由机器人液体处理器控制的集成分子生物学设施中处理大量遗传构建体的能力，结合高通量分析并由专用软件支持。DNA 构建体快速原型的生物铸造简化方案如图1A所示。学术生物铸造厂的一个值得注意的方面是，整个工作流程仍然没有完全自动化或在 DBTL 周期的所有级别进行集成。细胞 工厂建设中的中间步骤需要广泛的优化，大部分在平台外手动（至少部分）执行。此外，到目前为止，自动化在提供关于新陈代谢的深刻基础信息方面的能力还没 有得到充分利用。
传统微生物宿主（主要是大肠杆菌）的正向工程在 DBTL 循环的设计-构建阶段利用了生物铸造厂的潜力。最近的两个例子说明了工程大肠杆菌用于（2S）-黄烷酮和十二醇生物生产的半自动化方法。第一个例子是通过在自动化管道中组装表达构建体的组合文库来优化不同类黄酮的生物合成过程。基因部分被设计为通过连接酶循环反应与 DNA 组装完全兼容，并通过液体处理机器人平台执行计算机移液工作流程。应用这种半自动 DBTL 程序，以甘油为原料，获得了高滴度的柚皮素（484 mg/l）、松脂素（198 mg/l），高滴度（55 mg/l，以咖啡酸酯为原 料）和后莫圣草素（17 mg/l）。在第二个例子中，使用基因库和核糖体结合位点 （RBS）系统地操纵基因表达强度，用于十二醇生物生产。通过测试来自大肠杆菌 MG1655 的 60 株工程菌株，实施了两个连续的 DBTL 循环以增强葡萄糖的产物形成。在第一次迭代中，通过采用一组预测强度不同的 RBS 来调节不同酰基 载体蛋白（ACPs）/酰基辅酶 A（CoA）还原酶基因的表达。硫酯酶和酰基辅酶 A 合成酶基因同样被纳入这些设计中。接下来，将这些实验中产生的蛋白质浓度和产品产量数据输入机器学习算法，以预测进一步的优化步骤。基于计算机预测 的第二次迭代使十二醇滴度（0.83±0.13 g/l）比第一次循环的基础菌株提高了21%。重要的是，Opgenorth 及其同事的研究在实现机器学习算法提出的设计时暴露了缺点。挑战包括（i）可用RBS对蛋白质含量的可预测性有限，（ii）途径 蛋白的非靶向效应（例如 FadD 酰基-辅酶 A 合成酶的表观毒性），（iii）通过改变 单个 RBS（例如极性）带来的整体操纵子效应，（iv）当使用密切相关（与完全 组合相反）构造的训练集时，掩盖整个数据空间中的局部趋势，以及（iv）需要大数据集来可靠地训练机器学习路径。
最近的另一项研究描述了一种半自动管道，用于优化酿酒酵母工程菌株生产白桦酸（一种五环三萜）。作者应用了 SCRaMbLE，这是一种体内诱导的合成染色体缺失系统，目的是生成多样化的菌株库。白桦酸途径模块的设计和构建阶段 是手动进行的，而测试部分是通过实施自动化高通量筛选方法来执行的。因此， 该文描述了使用酵母细胞工厂的全自动化生物生产过程的最接近的例子之一，有可能包含实现完全自动化的额外步骤。另一种真菌物种假土曲霉（Aspergillus pseudoterus）已进行了深入的、多组学指导的工程，用于聚合物前体 3-羟基丙酸 （3-HPA）的糖依赖性生物合成——在生物反应器培养物中，滴度可达 0.88±0.11 g/l。该方法基于蛋白质组学和代谢组学，鉴定能够从预期的 3-HPA 合成途径排出通量的上调蛋白。建立了合成β-丙氨酸依赖的产物形成途径，并通过删除负责 3-HPA 降解的丙二酸半醛脱氢酶基因（Apald6）重新定向乙酰辅酶 A 通量。
这个章节的讨论提供了自动化潜力的原理示例。这些开创性的研究还揭示了一个事实，即大体上，模式生物是首选的生物铸造宿主。只有将细菌宿主的种类大大扩展到大肠杆菌之外，特别是生产非普通化学品，生物铸造厂的全部潜力才能实现。这项工作需要一个自动化的管道来实现非模型生物的合成工具集，同时需要组学驱动的对其代谢和生理学基础知识的扩展。下一节将讨论生物铸造厂如何成为这方面的关键参与者。
05
通过自动化和扩展合成生物学工具箱为基于非传统宿主的细胞工厂铺平道路
体内 DNA 模块的构建和组装以及从头途径设计是细胞工厂开发的重要组成部分。将这些技术推广到非传统宿主可以标志着从缓慢驯化到合理设计的转变， 克服复杂代谢网络和有限的微生物生理学知识带来的障碍。由于物种间的功能不相容性（例如，RecA 介导的重组较差），为生物技术主流的基因工程建立的方法很难转移到非模型宿主。最近为非模式生物量身定制了一些尖端技术，但仍有很大的改进空间——尤其是在准确表征这些替代宿主中的工具方面。将非传统微生物整合到生物铸造管道中，不仅可以开发出新的（潜在的，更高级的）细胞工厂， 而且还将刺激对这些宿主的基础研究。生物铸造厂可以生产大量的表型和组学数据，如果这些数据被广泛提供给科学界，将成为学术界和工业界研究的指导资源。对新分离的微生物及其工具箱进行表征，这项过去需要几十年的努力，现在可以简化并以很小的时间和成本进行。稍后将讨论假单胞菌的基因组工程，以说明生物铸造厂在实现这些目标方面可能发挥的作用。
工具箱优化和大规模复用是 DBTL 周期构建阶段的两个重要方面，以释放非传统主机作为单元工厂的潜力。假单胞菌基因组工程已经针对手动工作流程进 行了优化，但它可以进一步发展为自动化设置。到目前为止，最快的恶臭假单胞菌基因缺失方案需要将自杀质粒共整合到感兴趣的位点中。整合位点和要切除的区域由自杀质粒中两个同源臂（HA）的序列决定；用户可以自由选择这些臂来介导细菌染色体中几乎任何位置的同源重组（HR）事件。通过在 HA 中加入遗传元素，这些特征同样可以整合到目标基因座中。通过从辅助质粒表达基因而反 式提供的 I-SceI 归巢巨核酸酶引入双链 DNA 断裂，从而迫使第二个 HR 事件从基因组中移除质粒骨架和靶区。通过将质粒复制的合成控制纳入所谓的 pQURE 质粒工具集，这一策略得到了升级，通过向培养基中添加 3-甲基苯甲酸盐，可以 严格控制质粒的繁殖。然而，这些方法的潜力有待充分挖掘。例如，自动化可以用于在几轮迭代中生成大型构造库。为此，可以采用克隆标准，例如标准欧洲向量架构（SEVA），以模块化方式组装复杂回路，从而产生与许多革兰氏阴性宿主兼容的广泛宿主范围构建体，同时促进遗传部分的可重用性。在这里，作者提出了一个通过自动化和并行化相结合的非传统革兰氏阴性菌快速基因组工程的原型工作流（图1B）。该工作流程包括（i）遵循标准的模块化 DNA 部分的平行和自动组装、（ii）用组装的构建体对大肠杆菌进行电转化，（iii）高通量纯化质粒 DNA 并用质粒文库转化所需宿主，随后（iv）用自固化 pQURE 载体转化并对所得无质粒菌株变体进行基因分型。该工作流程中的所有步骤都可以通过集成在机器人平台中的自动液体处理器轻松控制。
虽然已知该工作流程中提到的所有技术都可单独应用于 P.putida，但需要对其他宿主中的功能元件和部件（例如抗生素标记、基因表达系统、HR 机制和效率、转化方案和反选择标记）进行快速和自动原型设计，以验证其性能。可使用广泛使用的技术（例如，USER 克隆、Golden Gate 克隆、Gibson 组装或 SureVector） 组装此类管道中使用的质粒，并且根据所选择的方法，自动化协议最近已经可用。按照标准化的克隆策略，一旦创建了大多数部分，就可以重新用于多种构建体——例如质粒主干。鉴于整合质粒中作为 HA 所需的特定 PCR 扩增子大小相等（约 500 bp），而不考虑靶点，这些 HA 可以以高通量方式获得，例如 96 孔板（图 1B 中的步骤 1）。对于许多克隆策略，DNA 片段的组装可以在相同的布局中进行， 甚至无需事先纯化。一旦质粒组装好，它们就以 96 孔电穿孔板形式转入大肠杆菌进行繁殖（图 1B 中的步骤 2）。通过克隆 PCR 和 Sanger 测序验证质粒的正确 性。再次，使用标准化引物集进行验证，这样这一步骤也可以自动化。由于 Sanger 测序价格合理，克隆效率通常很高，这种方法既具有经济竞争力，又快速，因为不需要 DNA 纯化或凝胶电泳，从而实现高通量。图1B 中的步骤 3 说明了使用 市售 DNA 提取试剂盒以 96 孔板形式纯化质粒。然后通过电穿孔、化学转化或缀合将纯化的质粒引入感兴趣的（非传统）宿主中，回收后，将细胞接种到选择性培养基上以选择亚倍体。请注意，将细菌悬浮液分散到选择性琼脂平板上以分离单个菌落是序列中的关键步骤，但基本上没有实现这一目的的全自动化、高效的方案。该方案的最后一部分（图 1B 中的步骤 4）涉及通过在亚二倍体克隆中引入 pQURE 系统来强制第二次HR事件，然后进行质粒固化。可以使用阴性选择标记（例如，sacB）来促进质粒消除，从而实现更高的产量。序列的最后一步是通过克隆 PCR 和 Sanger 测序进行基因型确认，如质粒构建阶段所示。此时， 菌株库已准备好进入测试阶段，即多组学方法促进的代谢网络分析。
06
引入以代谢为中心的分析作为发现平台，指导 DBTL 循环中的工程工作
采用非模式生物作为底盘的主要挑战不仅是基因工程工具的相对缺乏—— 这可以通过实施上一节中建议的管道部分解决——而且关于代谢结构及其调控的信息有限。因此，需要对不同环境条件下的代谢进行详细分析，例如遗传或化学干扰，以了解代谢结构和调节。反过来，这些信息可以用于确定与生物技术相关的可行代谢景观。与自动化和合成生物学协同提高细胞工厂建设的速度和产量一样，自动化与多组学分析相结合可以扩展对代谢网络的知识。在计算数据集成的支持下，用于系统生物学目的的多组学已经取得了重大进展，这允许全面理解跨多组学层的代谢网络。多种检测和测量技术可用于捕获基因型-表型之间的信息，包括 DNA 和 RNA 测序（即基因组学和转录组学）、基于质谱（MS）的代谢组学、蛋白质组学和通量组学以及核磁共振。图 2 以加速基因组工程、多组学分析和自动化相结合的中心思想为基础，为 DBTL 循环提供支持，同时解决微生物代谢的基本问题。
这种类型的多组学分析体现在代谢中心观点在不同微生物中的一些应用中。不足为奇的是，其中两个例子中采用了一种因其多功能和复杂的代谢而被广泛认可的非传统宿主——P.putida。该文讨论的实例包含了对（i）δ-戊内酰胺（哌啶 -2-酮）作为唯一碳源的利用和ε-己内酰胺（氮杂环己内酰胺）的分解代谢，以 及（ii）复杂的脂肪酸和酒精代谢的多组学探索。在第一个例子中，作者通过使用随机条形码转座子测序（RB-TnSeq）和鸟枪蛋白质组学的组合来研究δ-戊内酰胺分解代谢，以提高内酰胺滴度。一个特定位点（oplBA）被鉴定为编码负责启动δ-戊内酰胺分解的功能。接下来，删除 oplBA 基因以防止δ-戊内酰胺在富培养基中降解，这也减少了ε-己内酰胺的消耗。然后，使用关键代谢前体（即 L-赖氨酸或5-氨基戊酸）的途径也被删除，使得δ-戊内酰胺滴度从检测不到的显著增加到约 90 mg/L。在第二个例子中，RB-TnSeq 技术被用于为参与脂肪酸和酒精分解代谢的酶分配功能迄今其作用原理未知。通过序列同源性将功能分配给孤儿酶可能极具挑战性，因为许多假定的旁系基因编码相似的活性，可以共存，同时显示不同的调控模式。在这种情况下，在对不同脂肪酸和醇作为唯一碳源的转座子文库进行深度适应度分析后，强表型可追溯到数百个基因。根据在不同链长的脂肪酸上培养突变体池的实验数据推断酶底物偏好。一个特定的蛋白质家族，称为 DUF1302/DUF1329，被假设起酯酶的作用。此外，还发现了异戊醇（3-甲基丁烯-3-烯-1-醇，一种半萜醇）和异戊醇（3-乙基丁-1-醇）分解代谢的新途径。这些醇被提议在初始氧化步骤和通过 CoA 连接活化后通过 L-亮氨酸代谢分解。由于脂肪酸和醇都是生产重要生物产品的关键前体，这项研究的结果必将指导未来的菌株设计。
细胞工厂构建过程中的代谢中心观点也体现在腔色链球菌产生聚酮抗生素放线素的过程中。在这里，基于代谢组学和转录组学的分析表明，环腺苷酸 （cAMP）浓度与放线素生物合成密切相关，这似乎是一种调节性、多效性效应， 而不是直接的前体喂养。这一初步迹象导致作者在培养基中补充 cAMP。随后的多组学分析表明，补充 cAMP 后，鸟嘌呤浓度增加。通过使用胍类似物7-甲基鸟 嘌呤抑制了胍依赖性反应，这排除了 cAMP 的积极作用，表明同源反应介导了细菌生长和抗生素生产的积极作用。
最后，通过自动化将细胞工厂建设推向下一个水平的以代谢为中心的方法可 以依赖于将细菌生长与感兴趣分子的生物合成耦合，或将最终促进生物质形成的多个代谢模块耦合。携带生长耦合模块的菌株可以通过适应性实验室进化（ALE）进化，以改进表型丰富种群。这种方法将显著减少筛选时间，因为识别高产量变体的参数是细菌生长。这种策略在构建细胞工厂以生物合成难以生产的化合物时尤其有用，例如卤化分子，这些化合物需要大量的分析工作来检测和定量。
07
观点总结和未来方向
生物铸造厂是在生物工业的框架内出现的，以加速细胞工厂的发展。优化工作流程，为可持续化工生产建立高性能、工业级微生物平台，是现有生物铸造厂的座右铭，无论是在工业界还是学术界。然而，利用生物铸造厂的生产能力和概念框架 来获得微生物生理学和代谢的基本知识，进而将这些信息反馈到工作流程中，以支持细胞工厂设计，这一潜力尚未得到开发。同样，重新编程也为进一步深入了解生命系统的复杂性提供了基础性的见解，为后续的工程设计提供了动力。这一概念将有助于为生物技术和生物医学重新编程细胞建立通用（而非生物特定）生物设计规则。
自动化是这些发展的关键，但并非没有挑战。为了使整个实验室工作流程自动化，管道中实施的协议必须一致，提供精确的量化并确保再现性。尽管支持技术越来越可靠，但仍有很大的改进空间，因为在系统或多或少独立运行之前，实现自动化例程仍然需要耗时的优化。与这些努力相结合，多元组学分析也带来了一些障碍。很明显，过去的学习在目标分子和微生物宿主之间并没有很好地传递， 而且实验数据集的质量、数量和一致性往往不足，无法从中学习，即使是大肠杆菌或酵母。因此，数据管理至关重要，因为深度和高通量分析会产生大量数据集。由于这些不一致性，多组分数据集成相当具有挑战性，在开放获取环境中跨生物铸造厂的数据比较将至关重要。幸运的是，已经建立了一些计算工具以及统计工具箱来支持这些发展。如上述的一些示例所示，由于机器学习的预测能力，它也成为合成生物学的坚实支柱。
作者认为，为该文所述目的调整生物铸造厂可以以相对简单的方式完成。在持续的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）大流行期间，生物铸造厂的多功能性已成为一个明显的例子，因为卫生危机暴露了创新和快速适应的生物技术方法对抵消其影响的重要性。迅速调整现有科学基础设施和劳动力的用途， 从而开发出安全有效的候选疫苗。按照同样的推理，可以预期，重新启动生物铸造厂以支持基本发现将扩大对非传统微生物固有代谢复杂性的现有理解。因此， 在 DBTL循环中应用以代谢为中心的层将在未来通过生物合成途径获得化学物质来升级工业生物技术，而到目前为止，这些化学物质已超出常用细胞工厂的生物学范围。尽管仍有一些挑战有待解决（见未决问题），但该文中提出的一些解决方案可能有助于在急需替代石油生产（受到各种政治和经济影响）的时候巩固生物经济。
08
未解决的问题
非传统宿主中复杂（和有利）细胞性状的生化和遗传基础是什么？
合成生物学能否实现这些特性的正向工程？
生物铸造厂会根据预期应用以及大量的底盘集来选择最合适的宿主吗？
自动化是否可以通过便利通常耗时的协议来推动处理代谢工程的方式的革命？
这些以代谢为中心的自动化序列在多大程度上有助于在实际工业规模上部署非传统细胞工厂？
全文完
参考文献：Gurdo N, Volke DC, Nikel PI. Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes. Trends in Biotechnology. 2022;40(10):1148-59.
Mediacenter Editor | 曼森编辑
文章来源：本文由中科院上海生命科学信息中心与曼森生物合作供稿
排版校对：刘娟娟编辑
内容审核：郝玉有博士
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