细胞实验和动物实验过程中的给药剂量和注意事项
2023-03-29 来源:本站 点击次数:19603
小白：拿到产品后都不知所措了，之前拿到的产品一不小心就选错了溶剂，直接废掉不能用了，扔掉的都是白花花的经费啊。
师兄：拿到产品不能想当然的就动手，要多查资料查文献。科学研究一切都是要有理有据有出处的，即使没有相关文献也是需要查阅大量相似资料奠定理论基础，设置梯度来摸索的。一切都是不容易的。
萌 Cece：给药是个大工程，需要大量的理论基础和文献参考，只有站在巨人的肩上，我们才能看的更远，走的更久
不同的产品，不同的给药方式和给药剂量，即使是同一产品，不同的细胞，不同动物模型，给药剂量也是不一样的。拿到产品后，我们要根据产品名字和自己的实验设计，有目的的去查文献。
■ 细胞实验，剂量如何查询
细胞实验一般是将小分子药物加入培养基，与细胞共孵育来发挥作用的。给药剂量查询如下所示：输入产品名字，细胞系名称，剂量单位(小分子抑制剂一般用量在 µM 的比较多，重组蛋白类的一般用量在 ng/mL 的范围)，文献搜索后，参考文献的使用浓度和使用时间，设计自己的实验。
Tips: 也会有小伙伴遇到自己的细胞系没对应文献的情况，建议根据其他细胞系文献的使用剂量，设置梯度进行 “剂量-效应” 曲线预实验，确定合适的使用浓度再进行后续的功能研究。
图 1. 细胞实验文献查阅
■ 当小分子抑制剂遇到转染
当然，并不是所有的剂量组都只有小分子化合物，有些伙伴可能会纠结 “我还要给细胞转染，这个时候我要怎么加药呢？” “除了小分子抑制剂，我要加我自己合成的其他药物，该是怎样怎么加药呢？”
如下面这篇文章里，作者团队探究 κ 阿片受体 (KOR) 在 食管鳞状细胞癌 (ESCC) 中的作用及其潜在机制，研究者前期使用 siRNA 敲低 KOR 表达，发现 KOR 下调增强了 ESCC 细胞的增殖、转移和侵袭能力。激活 PI3K -Akt 通路对肿瘤细胞（经 siRNA 敲低 KOR 表达处理）的增殖有促进作用，为探究 AKT 的激活是否是导致转染 siRNA-KOR 的肿瘤细胞的增殖、入侵和迁移的原因，使用小分子抑制剂 HY-10249A (0.5 μM) 对其进行处理[1]。
注意文献这里的描述：“following KOR knockdown”，小分子抑制剂是在转染之后加的，HY-10249A ，AKT 激酶抑制可以逆转 KOR 的抑制对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。
图 2. 细胞实验文献查阅
图 3. AKT 激酶抑制可以逆转 KOR 的抑制对细胞增殖、侵袭和迁移的影响[1]
敲黑板: 请注意，这里是案例，实际给药还需多多参考文献！
关注关注文献中的 Method 部分，搜索关键字以及做好整理。
搜关键字以及做好整理。常见关键字 Pretreatment，co-treatment, following, before treatment 等等。动物实验的给药方式包括口服，灌胃，注射 (皮下注射，皮内注射，静脉注射，腹腔注射，肌肉注射等)，具体可参考小 M 的往期推文：给药方式犹豫不决？不看你就亏了。
在动物实验给药之前，首先明确自己的实验动物和实验模型，再用关键字查阅文献选择合适的给药方式进行实验设计。如下所示：
在查阅文献的网站搜索框中输入产品名称，动物模型，剂量单位(小分子类产品一般 mg/kg 较多)，搜索文献，搜到文献后参考文献剂量设置梯度进行就可以啦！
还是以 LY294002 为案例，假设你用的小鼠是 BALB/c 小鼠，准备做乳腺癌相关研究，那么你可以关键字可以这样设置！“LY294002 breast tumor BALB/c mg/kg” 或者 “LY294002 breast cancer BALB/c mg/kg”。
好了，查到大量文献后，请进入阅读学习模式！
图 4. 动物实验文献查阅
还有这样一种情况，可能你查到的文献都是小鼠，但实际你要做的是大鼠，但是找不到文献支持，下面策略可以考虑:
汇总好查阅的关于小鼠的给药剂量的文献。
使用常见物种给药剂量的相互换算，如下表 1 所示，根据公式 Animal rat (mg/kg) = Animal mouse (mg/kg) multiplied by (Animal mouse Km/Animal rat Km)。即大鼠体内的给药剂量为小鼠给药剂量的一半 (请注意，严谨起见，设置浓度梯度剂量组)[2]。
实验方案确定好了之后，下一步就是药物溶解了。
■ 友好溶剂：水
水溶性的产品，细胞实验时可以用纯 ddH2O 配置 20-100 倍的储液，使用时培养基稀释到工作液浓度后 0.22 µm 滤膜过滤。
■ 溶解界老大哥：万能溶剂 DMSO
很多产品并不溶于水，这时候，我们的万能溶剂 DMSO 就闪亮登场了。
细胞实验可以根据您的最大使用浓度，配置 1000X 的储液，使用时培养基稀释到工作液浓度。
Tips: 有时候可能会遇到产品本身溶解度不高的情况，无法配置 1000X 的储备液；要做好溶剂对照，排除下 DMSO 对实验结果的影响。
但溶剂的选择，也不能想当然是 DMSO，前切记切记多看说明书。
注：MCE 说明书的溶解方案都是实测数据。有些产品很有可能是万能溶剂也溶解不了，番茄红素为例，它的溶剂是 THF 四氢呋喃。此外，其他有机溶剂 DMF (铂类物质的好朋友)，丙酮等，虽相对 DMSO 使用较少，但它们还是药物溶解的好溶剂！见往期推文：溶剂大比拼—细胞实验篇。
■ 友好溶剂：水或者生理盐水
您如果选择 PBS 或生理盐水配置，溶解度参考水中的溶解信息，配置好后 0.22 µm滤膜过滤，直接使用不可储存。因 PBS 或生理盐水的成分相对复杂，长期储存不确定是否会影响产品活性，所以不建议用 PBS 或生理盐水陪住储液。
动物实验时，您可以根据水中的溶解度信息，选择用双蒸水配置 10 倍的储液，使用时 PBS 或生理盐水稀释 10 倍；如果溶解度受限，无法配置 10X 的水中溶解度，需用 PBS 或生理盐水现配现用。
■ 对于有机溶剂溶解的产品（如 DMSO）
正常小鼠可用 DMSO 配置至少 10 倍的储液，使用时加助溶剂稀释 10 倍，做好溶剂对照就可以了。
在这里给大家安利一个小工具！进入公众号打开 “实用工具-溶解度计算器”，输入产品货号，输入小鼠体重，给药体积，小鼠数量以及给药周期：
■ 免疫缺陷鼠，如裸鼠，NGS 小鼠等体弱小鼠，一般建议配置至少 50X 的储液。
可能有小伙伴要问：50X，这是什么意思？此处以Rapamycin (HY-10219) 为例，一般小鼠体内的给药剂量在 1-10 mg/kg。假设给药 8 mg/kg [3]，小鼠体重为 20 g，腹腔注射，200 µL 的给药体积。
我们最终的工作液浓度是 0.8 mg/mL，50X，就是配置 40 mg/mL 的储液 (此产品在 DMSO 中的溶解度为 125 mg/mL，可以满足），使用时按照 2% DMSO+40% PEG300+5% Tween 80+53% saline 稀释给药。
动物实验中，有些模型给药剂量较大，可能无法配置 10X 或者 50X 储备液，那么需要考虑现配现用的方案，比如 0.5% CMC-Na/saline (HY-Y0703），50% PEG 300 (HY-Y0873) +50% saline 等方案可选 (详见往期推文：动物实验溶剂大 Battle！)。
但无论哪种实验方案，建议使用前先取少量尝试，能达到澄清溶液或均匀的混悬液，腹腔和口服给药都是可以的。
生物实验是一个不断摸索和尝试的过程，给药剂量，给药方式，溶解方案等都是要在文献的基础上摸索，这样才能达到事半功倍的效果。以上是萌 Cece 对溶解，给药等的一些建议，仅供参考。
最后，萌 Cece 祝大家实验顺利，paper 多多~
参考文献
[1] Cell Commun Signal. 2022;20(1):35. Published 2022 Mar 19.
[2] Arch Physiol Biochem. 2022 Apr;128(2):426-430. PMID: 31746232.
[3] Elife. 2016 Aug 23;5:e16351.PMID: 27549339.
点击化学：https://www.medchemexpress.cn/click-chemistry.html