结膜疾病是一种严重影响患者视力的眼表疾病。利用结膜干细胞（CjSC）进行干细胞治疗已成为治疗结膜疾病的一种很有前途的方法。然而，关于CjSC的培养和微创CjSC移植的研究仍然不足。在这里，利用CELLINK的BIONOVA X 3D生物打印机开发了一种负载CjSC水凝胶微结构 (Hydrogel micro-constructs)。生物打印的水凝胶微构建体可以支持CjSC的活力、干细胞表型和对结膜杯状细胞的不同分化效力。这些具有可调力学刚性的细胞水凝胶微结构可用于CjSC的扩增动态悬浮培养，或作为一种载体，通过微创结膜下注射将CjSC输送至球结膜上皮，作为干细胞治疗眼病的方法。
关注重点：
1. 3D生物打印的负载细胞微水凝胶载体能支持高细胞活力。
2. 水凝胶载体的力学刚度对细胞活力的直接影响与条件优化。
3. 能维持CjSC的表型和分化潜能。
4. 动态悬浮培养对细胞活力以及细胞增殖和分化潜能的影响。
5. 负载细胞微水凝胶载体的离体结膜下注射 。
       
CELLINK的BIONOVA X 是基于DLP（Digital Light Procession）的3D生物打印专利技术, 能提供一种制造3D构建体的工作流程，该构建体保持高细胞活力，并满足许多关键要求，可转化为干细胞疗法（Fig 1）。BIONOVA X可以在极短的时间内以高分辨率和高通量轻松打印定制的3D几何图形（一个结构的时间 30秒）。这样的过程降低了细胞污染和不必要的暴露的风险，从而导致细胞活力降低。此外，悬浮在水凝胶中的细胞，  BIONOVA X 它允许调整水凝胶力学刚度，这直接影响细胞的活力。另外还能确保细胞保持封装和固定，最大限度地提高它们对植入的影响。
        这种高通量解决方案可以快速产生多种不同结构与刚性的含细胞微水凝胶载体（直径100μm，高度100μm）。这种高通量制造，再加上高细胞活力验证筛选，证明了使用BIONOVA X作为细胞治疗开发的可扩展制造方法的巨大潜力。          
细胞外基质（ECM）的力学特征在细胞分化和增殖过程中起着关键作用。然而，ECM力学特征对CjSC行为的影响仍不清楚。研究支架刚度和曝光时间之间的关系，以确定封装CjSC的最佳打印条件。应用四个暴露时间（即15秒、20秒、25秒和30秒）来制造支架。考虑到通常与CjSC相关的体内环境，确定通过20秒的暴露时间可以有利地满足较软的硬度。这种较短的曝光时间也确保了减少细胞对光的任何不必要的曝光 (Fig 2)。        
为了用CjSC建立有效的细胞疗法，维持干细胞特性至关重要。在这里，我们在CjSC包封的微水凝胶载体上进行了为期6天的培养，研究结果证实3D微水凝胶载体支架是可以长时间维持被包封CjSC的干细胞表型和分化潜能 (Fig 3)。        
要开发一种可临床转化的产品，可扩大制造是一个必不可少的要素。动态悬浮培养被认为有利于提高营养物质的吸收、降低成本和提高产量。为了探索细胞增殖的可扩展性和负载细胞的微水凝胶载体作为临床应用的细胞递送系统的潜力，对含CjSC微水凝胶进行了动态悬浮培养。其结果证明BIONOVA X打印的3D微水凝胶载体中， 与静态条件下培养比较，动态悬浮培养的细胞活力更强。同时有效地保持了包埋在微水凝胶中的细胞的增殖和分化能力(Fig 4)。证明了这种扩大生物制造的途径，以及增加了制造这种基于细胞的疗法的可行性。        
微水凝胶载体本身的粘度具有剪切稀化特性。剪切变薄特性对注射过程至关重要，因为它在注射过程中保护包封的细胞免受剪切力的影响，并确保水凝胶载体在移植后保持其保真度并支持其固定。通过临床使用的30号针头（内径~159μm）将载有细胞的水凝胶注射到离体兔眼的球结膜上皮中。验证3D生物打印的载有细胞的微水凝胶构建体可以作为通过微创注射将CjSC递送到靶向结膜下区域的良好载体。除了治疗眼表疾病外，这种可临床转化模型还可以进一步扩展到其他体内细胞治疗应用。