本期遗传学与整合组学课题组为大家带来的是2016年5月发表在Nature genetics 的‘Pancreatic cancer risk variant in LINC00673 creates a miR-1231 binding site and interferes with PTPN11 degradation’一文，关于长链非编码RNA-LINC00673中的一个胰腺癌风险变异在疾病易感性中的相关研究。

研究背景

近年来发表了许多全基因组关联研究（GWAS），确定了近6500个与疾病或性状相关的基因位点。然而，只有7％的基因位点位于蛋白质编码区，而93％位于非编码区。蛋白质编码区域的突变通常是非常有害或致命的，因此癌症发展之前这类突变的携带者可能不会存活；然而，调节区域的突变能以细胞类型或组织特异性方式引起基因表达的细微变化，这可能会导致载体对癌症的易感性。lincRNAs是长度超过200nt的基因间非编码RNA，为人类非编码转录组中最大的亚类，许多GWAS鉴定的基因位点位于编码lincRNA的区域，这表明lincRNA遗传变异可能在癌症等疾病易感性中起重要作用。

  简  介

全基因组关联研究(GWAS)作为一种高通量的研究方法,近年来已帮助生物医学研究者们发现了一些与胰腺癌易感性相关的基因及遗传位点,然而影响胰腺癌发生、发展的遗传易感因素仍未被完全阐明。

本篇报道作者从这一点出发，进行了一系列数据分析：利用中国人群胰腺癌数据进行GWAS分析，鉴定新的与胰腺癌易感性相关的基因及SNP（单核苷酸的多态性/单个碱基上的变异），最终筛到46个有价值的SNP。其中一个SNP：LINC00673外显子4上的rs237位点(鸟嘌呤转换为腺嘌呤)与PDAC发病风险显著相关，作者对其具体作用进行了深入的研究。

研究结果

图A是显著易感基因座内关联结果和重组率的区域曲线图，通过归属分析对以rs237为中心的2-Mb区域进行了精细定位，发现4个SNP处于完全连锁不平衡，2个SNP处于强连锁不平衡。之后在rs237上进行条件作用后，发现在该区域几乎不存在第二个易感等位基因。B图生存曲线结果显示：rs237基因型与生存率无明显相关性。总之就是他们鉴定到linc 673中rs237的突变是PDAC易感因素。

A图细胞及B图组织qPCR结果都显示：673在癌组织中表达降低。C图分析GEO数据库，D-E分析其他癌症类型（食管鳞状细胞癌(ESCC)、肝细胞癌(HCC)）结果也都显示在癌组织中673低表达。F图TCGA数据分析显示不同癌症类型中其表达水平存在一定差异。G-H qPCR和TCGA生存曲线结果都证明：673表达与PDAC生存率无相关性。总之前面2组生信分析结果表明：LINC00673中rs237的突变与PDAC易感性相关而与生存率无关，在癌组织中673水平降低。

许多证据表明miRNAs能够与lincRNAs相互作用，调节lincRNA水平，作者推测673的SNP可能通过构建或破坏某些miRNAs的结合位点来影响其表达水平。附图A-B通过软件分析发现rs237上的鸟嘌呤转换为腺嘌呤的突变会改变673的局部折叠结构和自由能，附图C图显示这种突变可能为miR-1231构建结合位点。接着A图荧光素酶报告分析实验显示：当加入miR-1231时，rs237[A]等位基因构建体荧光素酶活性显著降低，且随着miR-1231浓度增加这种降低作用更明显。B图显示当加入miR-1231抑制剂后，附图D显示尽管miR-1231在这2种PDAC细胞系中仍有结构性表达，但miR-1231和rs237[A]之间的特异性互作被完全挽救。C图瞬时转染miR-1231后，qPCR测A、G这2种673的表达情况，结果显示：miR-1231只降低了673[A]的表达水平，说明673[A]是miR-1231的靶标。D图qPCR评估了rs237基因型对PDAC癌旁组织中673水平的影响，结果显示GG基因型个体的673水平显著高于GA或AA基因型个体。E图显示miR-1231的水平在不同基因型个体中表达相近，说明673的这种基因型特异性差异与miR-1231水平无关。附图E-G进一步分析了不同rs237基因型样本中673和miR-1231水平的相关性，发现在AA或GA基因型样本中miR-1231水平与673水平呈负相关，而在GG基因型样本中则不相关。附图H测了在2种PDAC细胞中673和miR-1231表达水平比较类似。总之这组实验证明：673突变体[A]是miR-1231的靶标，可以与miR-1231结合从而降低673表达水平。

接下来表型实验：A-D图CCK8法、E-F图细胞周期分布、G-H克隆形成实验3种方法一致证明：过表达673时PDAC细胞增殖减弱，细胞周期阻滞在G0/G1期，而敲除673后PDAC细胞增殖增加。附图B流式测凋亡结果显示673对PDAC细胞凋亡没有显著影响，附图C-E结果显示它对PDAC细胞迁移侵袭也没显著影响。

体内实验结果同样证明673抑制肿瘤体内生长。附图还对永生化胰管上皮细胞系进行了相同的实验，同样发现673过表达显著抑制了细胞的增殖和细胞周期，但不影响集落形成和迁移侵袭等表型。总之这组实验证明：673是一种抗肿瘤RNA可以抑制细胞增殖。

接下来探索与673互作的蛋白，图A RNA-pulldown及图B找到673-蛋白复合物，质谱分析发现该复合物中含有多种蛋白质，其中含量最丰富的是PTPN11。图C选了含量最丰富的前5个蛋白进行验证，结果只检测到了PTPN11。D-E 图RIP实验结果也同样显示PTPN11抗体沉淀复合物中673富集，这几个实验均表明PTPN11可能是673的关键靶蛋白。F图构建673的截短体，G图构建PTPN11截短体，最终找到了2者的互作区域：673  5’端1-448nt区与PTPN11  SH2-2结构域互作。H图显示敲低和过表达673时PTPN11  mRNA水平不变，但是i图显示蛋白水平发生变化，过表达673G时PTPN11表达降低，敲除673时PTPN11表达增加，这也就说明影响是发生在转录后，J实验通过蛋白质合成抑制剂放线菌酮处理，结果显示过表达673G 使得PTPN11半衰期缩短。K图蛋白酶体抑制剂MG132处理后，由673过表达造成的PTPN11的减少作用被逆转。这2个实验表明泛素-蛋白酶体途径可能在673介导PTPN11降解中起关键作用。L-m和附图A-B图WB结果显示：在过度表达673G的细胞中，PTPN11的泛素化显著增加，在敲除673细胞中，泛素化显著降低。也就是说：673与PTPN11互作，通过泛素化促进了PTPN11的降解。

在进一步研究673调节PTPN11泛素化的机制中，作者发现了几个与PTPN11相互作用的蛋白，其中包括已知的伴侣蛋白GAB2GRB2相关结合蛋白2亚型B以及PRPF19 mRNA预处理因子19，它是一种含U-box的E3泛素连接酶，可与其特定底物形成泛素化复合物。A-B图分别用RNA-pulldown和RIP实验验证了673与PTPN11结合，PTPN11与PRPF19结合，3者具有相关性。附图C-D显示673水平变化不会影响PRPF19表达变化，但673水平变化能影响PTPN11与PRPF19的互作，过表达673G促进PTPN11与PRPF19互作。所以就基本可以推测PTPN11是PRPF19的底物，E-F图通过敲除PRPF19，证明了敲除PRPF19后PTPN11蛋白水平增加，这是由于PTPN11泛素化减少所致。G图构建PTPN11截短体找到了它与PRPF19互作的结构域是SH2-2。总之这组实验共同证明：673G可能作为一个介质，强化PRPF19-PTPN11的互作，从而促进PRPF19介导的泛素化和PTPN11的降解。

前面已经发现miR-1231特异性结合673[A]，而不是673[G]，所以作者推测673对细胞增殖的抑制作用可能与这个特异性有关。A-D图实验结果证明：在miR-1231存在的情况下，过表达673[A]的细胞增殖速度更快，G0/G1阻滞更少。E图显示：在存在miR-1231时过表达673[A]的细胞中PTPN11泛素化显著降低。F图检测rs237位点3种基因型PDAC癌旁组织中的PTPN11蛋白水平，结果显示：GG基因型个体的PTPN11水平最低，AA个体PTPN11水平最高。总之这组实验结果证明：miR-1231特异性的与673突变体A结合，抑制PTPN11的泛素化和降解，从而促进癌细胞增殖生长。

接着作者研究673水平变化对PTPN11下游信号传导的影响，上述实验发现673对细胞增殖和生长有影响，所以作者将研究重点放在参与细胞周期进展的SRC-ERK通路。A图在过表达673G的细胞中SRC和ERK1/2蛋白总量没有显著差异，但是磷酸化ERK水平降低，SRC激活位点(416)的酪氨酸残基被低磷酸化，而SRC C末端抑制位点(529)的酪氨酸残基被过度磷酸化，且SRC-ERK信号下游基因的mRNA和蛋白表达水平也均发生了变化，其中包括MYC、cyclin A和cyclin D下降，p27上升，并且这种由673过表达导致的SRC-ERK信号和PDAC细胞增殖抑制的作用能被PTPN11的过表达所挽救。B图结果与A图刚好相反。STAT1是已知的PTPN11下游分子，C图结果显示673[G]的过表达增加了总的STAT1和磷酸化STAT1的水平，同时也增加了STAT1依赖的干扰素反应基因的mRNA水平（紫色条带），而这种促进作用同样可被PTPN11所抑制。D图敲低673[G]结果与C图相反。

E-F图通过敲除PTPN11发现得到了与673[G]过表达一样的效果，表明673的作用是由PTPN11介导的。G图分析了74例临床胰腺组织中673水平与SRC-ERK下游基因、STAT1依赖干扰素反应基因mRNA水平的相关性，总之这些结果显示：673的表达水平与SRC-ERK下游促癌基因成负相关，与抑癌基因成正相关且激活STAT1信号通路。

总结与展望

综上所述，本文作者通过GWAS分析发现了673与PDAC风险相关。673是一种抗肿瘤RNA，能够增强PTPN11与PRPF19的相互作用，通过泛素化促进PTPN11降解，从而抑制具有促癌活性的SRC/ERK信号通路的活化，同时还可以激活依赖STAT1的抗肿瘤信号通路，这两者均能维持细胞稳态并防止肿瘤发生。而当673上的rs237位点G突变为A，miR-1231可以靶向这个突变体，就会导致细胞中游离的673水平降低，从而减弱了它的抗肿瘤作用而导致癌症易感性。