染色体外环状DNA (extracchromosomal circular DNA, eccDNA)是一种存在于细胞核内但独立于染色体DNA的，封闭环状的非质粒DNA分子，存在于所有真核生物中。
 
eccDNA在肿瘤的发病机制、肿瘤异质性的演变和耐药等方面发挥着重要作用。eccDNA在历史上有很多名字，包括非常大型的癌症特异性环状染色体外DNA (ecDNA)，它携带致癌基因，经常在癌细胞中扩增。eccDNA的长度从数十碱基到数百万碱基不等。纳米孔测序兼顾长读长与短读长测序，是eccDNA研究的理想技术。
 
本期齐碳带您了解近期利用纳米孔测序进行eccDNA检测的相关研究。
 
 1.小eccDNA作为多种癌症诊断和监测的生物标志物
▲作者:
Noer JB, Hørsdal OK, Xiang X, Luo Y, Regenberg B.
▲DOI: 
10.1016/j.tig.2022.02.007.
 INFORMATION               
▲解读
小eccDNA具有成为癌症生物标志物的潜力。然而，在癌变过程中小eccDNA的形成机制和功能尚不清楚，同时，癌症患者血浆中的小eccDNA谱是否代表癌组织中的小eccDNA谱仍有待阐明。
 
本研究采用基于纳米孔测序平台的新型测序工作流程，对25例癌症患者(包括前列腺癌、肝细胞癌和结直肠癌)和独立验证队列(包括7例癌症患者血浆和14例健康人血浆)的组织和血浆中存在的小eccDNA的全长进行测序。
   
与非癌组织相比，癌组织中检测到的小eccDNA数量和大小均显著增加(分别为P = 0.040, P = 2.2e-16)，分布更加均匀，形成机制也不同。尽管小eccDNA在癌症组织和配对的血浆之间具有不同的基础特征和基因组注释，但它们具有相似的形成机制和癌症相关功能。来源于某些特定基因的eccDNA在组织(AUC ≥ 0.8)和血浆(AUC > 0.9)有很好的多癌种诊断价值，特别是与CEA/CA19-9水平结合时提高了对多癌种预测的准确性。来自ALK和ETV6的小eccDNA相结合具有较高的多癌诊断价值(AUC = 0.804)，可以从组织外推到血浆，在验证队列中显示出较高的阳性预测值(100%)和阴性预测值(82.35%)。
本研究表明，eccDNA作为一种独立、稳定的环状DNA分子，在组织和血浆中都可以作为理想的生物标志物，有潜力用于低成本的多种癌症诊断和监测。

 
2.eccDNA的纯化、全长测序和基因组来源定位
▲作者:
Luo X, Zhang L, Cui J, An Q, Li H, Zhang Z, Sun G, Huang W, Li Y, Li C, Jia W, Zou L, Zhao G, Xiao F.
▲DOI: 
10.1002/ctm2.1393.
INFORMATION
▲解读
染色体外环状DNA (eccDNA)是半个多世纪前发现的。然而，对其生物发生和功能的研究才刚刚开始。阻碍eccDNA研究的主要障碍之一是很难从细胞中获得纯的eccDNA。目前的eccDNA纯化方法主要依赖于碱法裂解得到粗环状DNA后，用核酸外切酶去除线性DNA。然而由于eccDNA的丰度低，尺寸不均匀，目前的纯化方法无法获得纯净的eccDNA。
本研究描述了一个新的三步eccDNA纯化(3SEP)程序，增加了一个步骤以特异性的恢复环状DNA，同时不恢复外切酶未能消化的线性DNA，因此3SEP可以进行高纯度和可重复性的eccDNA制备。此外，研究者还开发了一种将滚环扩增与纳米孔测序相结合的全长eccDNA测序技术，并相应的开发了一种全长eccDNA的调用算法(Flec)用于识别包含在滚环扩增产物中的多个串联eccDNA拷贝的共识序列，并将其映射到基因组相应位置。该方案预计未来将促进eccDNA的鉴定和表征，且具有诊断和临床应用的潜力。
对于熟练的分子生物学家来说，纯化eccDNA大约需要 1-2天，纳米孔文库制备和测序需要5-6天，经验丰富的生物信息学家分析数据需要1-5天。
本研究中使用的纳米孔测序方法主要用于鉴定小于10kb的eccDNA。
      3.逆转录转座子劫持alt-EJ用于DNA复制和eccDNA生物发生
▲作者:
Wang Y, Wang M, Zhang Y.
▲DOI: 
10.1038/s41596-022-00783-7
INFORMATION    
▲解读
逆转录转座子（Retrotransposons）在动物基因组中高度富集。逆转录转座子的激活可以改写宿主DNA信息，从根本上影响宿主生物学。虽然逆转录转座子的发育激活可以为宿主提供益处，例如对抗病毒感染，但不受控制的激活会促进疾病或潜在地推动衰老。激活后，逆转录转座子利用它们的mRNA作为模板合成双链DNA，在宿主基因组中插入新的片段。尽管它们编码的逆转录酶可以合成第一链DNA，但第二链DNA是如何产生的仍不清楚。
本研究报道了逆转录转座子劫持宿主的选择性末端连接(alt-EJ) DNA修复过程，以环化步骤合成其第二链DNA。研究使用纳米孔测序来检测逆转录转座子DNA复制的命运，发现其中10%实现了新的插入，而90%以染色体外环状DNA (eccDNA)的形式存在。将eccDNA的产生作为标示，研究者们通过进一步的遗传筛选确定了来自alt-EJ的因子对逆转录转座子复制至关重要。alt-EJ通过环化过程驱动长末端重复反转录转座子DNA的第二链合成，因此对于eccDNA的产生和新的插入是必要的。
该研究表明，alt-EJ在驱动基因组寄生逆转录元件的增殖中是必不可少的。研究揭示了这个还未被充分研究的DNA修复过程的一个保守功能，并提供了一个新的视角来理解和潜在地控制逆转录转座子的生命周期。  
参考文献：
[1] Noer JB, Hørsdal OK, Xiang X, Luo Y, Regenberg B. Extrachromosomal circular DNA in cancer: history, current knowledge, and methods. Trends Genet. 2022;38(7):766-781.
[2] Luo X, Zhang L, Cui J, et al. Small extrachromosomal circular DNAs as biomarkers for multi-cancer diagnosis and monitoring. Clin Transl Med. 2023;13(9):e1393.
[3] Wang Y, Wang M, Zhang Y. Purification, full-length sequencing and genomic origin mapping of eccDNA. Nat Protoc. 2023;18(3):683-699.
[4] Yang F, Su W, Chung OW, et al. Retrotransposons hijack alt-EJ for DNA replication and eccDNA biogenesis. Nature. 2023;620(7972):218-225.

2021年12月，齐碳科技通过5年的自主研发，成功推出国内首台商业化的纳米孔基因测序仪QNome-3841，并宣布首个生产基地竣工，正式开启纳米孔基因测序国产化时代。2022年6月，齐碳科技发布纳米孔基因测序仪QNome-3841hex，标志着国产纳米孔基因测序仪开始了矩阵化发展，这也为灵活测序场景提供全新的解决方案，将更好地满足市场应用的多元需求。
 
2023年8月，齐碳隆重推出自主研发的中通量纳米孔基因测序平台QPursue，该平台涵盖纳米孔基因测序仪QPursue-6k和QPursue-6khex及其配套芯片QCell-6k，代表着国内纳米孔基因测序技术的最前沿水平，标志着国产纳米孔基因测序仪向中高通量进阶。