免疫组化(IHC)实验操作过程介绍
2024-03-25 来源:本站 点击次数:198
免疫组化（IHC）实验，即免疫组织化学染色实验，是生物学和医学研究中不可或缺的一项技术。它利用抗原与抗体之间的特异性结合，通过显色反应来定位和检测组织或细胞中的特定抗原，从而揭示生物体内蛋白质的分布和表达情况。
在实验过程中，研究人员需要精心挑选适当的抗体，这些抗体能够特异性地识别目标抗原。随后，抗体与组织或细胞样本进行孵育，让抗体与目标抗原充分结合。接着，通过添加显色剂，使得结合了抗体的抗原部位呈现出特定的颜色，从而能够在显微镜下清晰地观察到抗原的分布和表达情况。
免疫组化实验具有高度的特异性和敏感性，能够检测到非常低浓度的抗原。因此，它在疾病诊断、药物研发以及生物学研究中具有广泛的应用。例如，在癌症研究中，免疫组化实验可以帮助研究人员了解肿瘤组织中特定蛋白质的表达情况，从而评估患者的预后和制定个性化的治疗方案。此外，免疫组化实验还可以用于研究生物体内各种生理和病理过程。通过检测不同时间点或不同条件下的抗原表达情况，研究人员可以揭示生物体内分子水平的动态变化，为深入理解生命活动提供有力的工具。
具体实验过程如下：
1、SP三步法
1）石蜡切片，常规脱蜡至水。
2)0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟
4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.
5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。
6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最/好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。
7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。
8)PBS冲洗，3分钟×5次。
9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。10)PBS冲洗，3分钟×5次。
11）显色剂显色（DAB等）。
12）自来水充分冲洗。
13）可进行复染，脱水，透明。
14）选择适当的封片剂封片。
2、即用型二步法
1）脱蜡、水化组织切片。
2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。
3) 0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。
4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。
7）应用DAB溶液显色。
8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
总之，免疫组化实验是一种强大而精确的生物学研究技术，它在推动医学和生物学领域的发展中发挥着重要作用。
在实验过程中，研究人员需要精心挑选适当的抗体，这些抗体能够特异性地识别目标抗原。随后，抗体与组织或细胞样本进行孵育，让抗体与目标抗原充分结合。接着，通过添加显色剂，使得结合了抗体的抗原部位呈现出特定的颜色，从而能够在显微镜下清晰地观察到抗原的分布和表达情况。
免疫组化实验具有高度的特异性和敏感性，能够检测到非常低浓度的抗原。因此，它在疾病诊断、药物研发以及生物学研究中具有广泛的应用。例如，在癌症研究中，免疫组化实验可以帮助研究人员了解肿瘤组织中特定蛋白质的表达情况，从而评估患者的预后和制定个性化的治疗方案。此外，免疫组化实验还可以用于研究生物体内各种生理和病理过程。通过检测不同时间点或不同条件下的抗原表达情况，研究人员可以揭示生物体内分子水平的动态变化，为深入理解生命活动提供有力的工具。
具体实验过程如下：
1、SP三步法
1）石蜡切片，常规脱蜡至水。
2)0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟
4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次.
5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。
6）滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜（最/好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。
7）滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。
8)PBS冲洗，3分钟×5次。
9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟-1h。10)PBS冲洗，3分钟×5次。
11）显色剂显色（DAB等）。
12）自来水充分冲洗。
13）可进行复染，脱水，透明。
14）选择适当的封片剂封片。
2、即用型二步法
1）脱蜡、水化组织切片。
2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。
3) 0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。
4）滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
5）滴加enhangcer增强剂，37℃30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。
7）应用DAB溶液显色。
8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
总之，免疫组化实验是一种强大而精确的生物学研究技术，它在推动医学和生物学领域的发展中发挥着重要作用。
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