GSK3调控Wnt/β-catenin影响牛骨骼肌纤维/脂肪生成祖细胞的成脂分化
2024-09-04 来源:本站 点击次数:1791
期刊：Biological Macromolecules
影响因子：7.7
伯豪试剂产品：伯优®细胞核分离试剂盒
研究背景
骨骼肌发育与肉用动物的生产力和肉质密切相关，骨骼肌是重要的食物来源。理解控制骨骼肌组成、发育和生长的遗传和生理机制对提高肉质具有重要意义。已有研究表明，肌内脂肪（IMF）的沉积与肌肉功能障碍、相关疾病和肉质密切相关。理解IMF沉积的调控机制及其影响对改善肉质至关重要，而肌卫星细胞（MuSCs）、侧群细胞和成纤维/成脂祖细胞（FAPs）参与异位脂肪生成。单核RNA测序（snRNA-seq）允许对单个细胞的转录组进行深度测序，用于评估细胞群体的异质性，识别稀有细胞类型。探索骨骼肌的细胞组成，以及不同细胞间的差异，以此揭露其对多细胞生物功能的影响。
伯豪产品
伯优®细胞核分离试剂盒
研究目的
通过单核RNA测序（snRNA-seq）揭示延边牛不同发育阶段骨骼肌细胞的异质性，探讨肌内脂肪细胞的起源及其沉积机制，Wnt/GSK3/β-catenin信号通路在FAPs成脂过程中的作用，对肌卫星细胞（MuSCs）成肌分化的影响。
研究结果
1. 单核RNA测序揭示不同发育阶段牛骨骼肌细胞的异质性
为了获得牛骨骼肌发育的细胞群体图谱并表征细胞异质性，我们对从出生后（D8）和成年（M18）牛骨骼肌组织获得的单核细胞悬液进行了基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq）。在过滤掉7720个捕获自D8的细胞后，剩余的7638个细胞根据相似的基因表达模式被归类为15个细胞簇。这些15个簇包含16至1520个细胞，占分析细胞总数的0.21%至19.9%，其中簇0是最大的亚群，簇14是最小的亚群。同时，M18形成了13个分离的簇，包含26至2019个细胞，占分析细胞总数的0.28%至21.91%。基于先前确定的标记物的表达，并使用t分布随机邻域嵌入（t-SNE）可视化数据确定了细胞种类，。通过此分析，我们确定了骨骼肌中的所有主要细胞类型，包括肌细胞、平滑肌、成纤维/脂肪生成祖细胞（FAPs）、卫星细胞（SCs）、成肌细胞、免疫细胞和内皮细胞，以及肌细胞的一个罕见功能特化区域——神经肌肉接头（NMJ）。通过表达规范标记基因，包括PDGFRA、DCN（FAPs）、PLN（平滑肌）、CD163和PTPRC（免疫细胞）识别非肌核簇。肌核群体的基因表达包括MYH1、CKM（肌细胞）、Pax3、Pax7（LOC532669）（SCs）、MyoD1、MYF5、SPOCK1（成肌细胞）。NMJ核为已知规范标记MUSK阳性。
2. 使用snRNA-seq鉴定牛骨骼肌发育过程中的细胞异质性
基于D8和M18的snRNA-seq数据的整合分析，并使用Seurat3.0通过识别锚点的方法校正批次数据，比较分析D8和M18两个发育阶段细胞簇。另外，还比较了不同发育阶段每个簇中细胞的比例，并观察到了阶段之间细胞组分比例的显著变化。结果显示，出生后牛骨骼肌中肌细胞亚群的比例为77.02%。随着骨骼肌的发育，成年牛骨骼肌中肌细胞亚群的比例为85.33%，增加了1.11倍。然而，在成年牛骨骼肌中，簇6中的FAPs（D8:7.53%，M18:4.58%）和簇8中的SCs（D8:3.94%，M18:1.44%）的比例分别下降了39.17%和63.45%。
3. 肌源性细胞亚群的轨迹推断分析
使用Monocle算法进行的轨迹推断分析揭示了FAPs、平滑肌和SCs之间的关系。根据伪时间分析的结果，簇6中的FAPs被确定为初始状态。在骨骼肌发育过程中，簇6中的一部分FAPs转变为簇5中的平滑肌细胞，而一小部分转变为簇8中的SCs。研究将前50个差异基因被分为六类，展示了决定预分支细胞向细胞命运1和细胞命运2状态分化的基因，显示了每个细胞状态中高度可变基因的趋势，并指出了三个细胞亚群之间的分化关系。
对D8和M18牛骨骼肌中FAPs共表达基因的分析显示，PDE1A、LVRN、COL4A1、COL4A2、EBF2和MEG3等基因发生了显著变化。基于GO富集分析，发现这些基因主要参与脂质结合、醛氧化酶活性、FAD结合、血小板衍生生长因子结合等生物学过程。此外，高表达的COL4A1和COL4A2基因主要富集在细胞外基质-受体相互作用、蛋白质消化和吸收、泛酸和CoA生物合成以及钙信号传导通路中。
4. 从延边牛骨骼肌中纯化FAPs和MuSCs
基于表面标记物PDGFRα、CD56、CD29等的表达，通过磁激活细胞分选（MACS）从延边牛骨骼肌中分离出FAPs和MuSCs。RT-qPCR结果显示，与MuSCs相比，FAPs中PDGFRα的表达显著增加，而Pax7的表达显著下降。同样，免疫荧光染色也观察到FAPs中PDGFRα蛋白特异性表达，MuSCs中检测到Pax7和MyoG的表达。
5. GSK3抑制剂LY2090314激活Wnt/β-catenin信号通路抑制FAPs的脂肪生成
FAPs是表达主要Wnt配体和受体的细胞群。为了进一步研究Wnt/β-catenin通路在牛肌肉来源FAPs中的作用，研究选择了GSK3抑制剂LY2090314和TNKS抑制剂XAV-939来激活和抑制Wnt/β-catenin通路。β-catenin的免疫染色显示，LY2090314处理96小时后促进了β-catenin从细胞质向细胞核的转位。在LY2090314阻断GSK3表达并激活Wnt/β-catenin通路后，FAPs中三酰甘油（TAG）和脂联素（ADP）的浓度显著降低，脂滴的形成也受到高度限制。研究还观察到脂肪生成基因（PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和FABP4）和甘油三酯合成基因（DGAT1和DGAT2）的下调。此外，Western blotting显示，在LY2090314处理后，FAPs脂肪生成中FAP抗原PDGFRα、PPARγ和C/EBPα的表达显著下降。这些结果表明，GSK3/β-catenin通路调节FAPs的脂肪生成，LY2090314通过阻止β-catenin的降解来抑制FAPs的脂肪分化。
6. XAV-939阻断Wnt/β-catenin信号通路促进FAPs的脂肪生成
1 μM XAV-939处理显著抑制了Ctnnb1的转录水平，而GSK3A和GSK3B的mRNA表达水平没有显著差异。此外，在抑制Wnt/β-catenin通路后，β-catenin的表达显著下降，与脂肪生成相关的基因和蛋白（PPARγ、C/EBPα、FABP4、DGAT）的表达增加，表明β-catenin的下调信号FAPs会促进脂肪生成。此外，与对照组相比，XAV-939处理显著增加了FAP中脂滴的聚集和填充，TAG和ADP的含量增加。
7. LY2090314激活Wnt/GSK3/β-catenin通路，增强MuSCs的自我更新和肌生成
为了进一步研究β-catenin对牛MuSCs分化的影响，研究使用了20 nM 外源性LY2090314处理细胞，同时在MuSCs分化过程中监测了β-catenin和磷酸化β-catenin表达的动态变化。Western blot结果显示，随着MuSCs分化时间的延长，pβ-catenin（T41）的表达下降，而β-catenin的表达增加。此外，20 nM LY2090314处理促进了β-catenin的稳定，延长了牛MuSCs的分化时间。EdU掺入分析显示，LY2090314处理后的前24小时内，EdU+细胞比例较高，MyoG的表达下降。虽然分化48小时后肌管形成减少，但是，分化72小时后肌管的融合指数显著增加，表明LY2090314可以促进MuSCs的更新和分化。LY2090314抑制GSK3活性并激活Wnt/β-catenin通路以促进β-catenin的稳定，显著增加了肌源性基因（MyoD、MyoG、MRF4和MYF5）的mRNA表达。Western blotting显示，Pax7的表达下调，而MyHC和MyoG的表达水平显著上调。相反，在1 μM XAV-939处理后，与MuSCs肌生成相关的基因和蛋白（MyoD、MyoG、MRF4和MyHC）的表达显著下降。
8. 3.8. GSK3抑制剂LY2090314激活Wnt/β-catenin信号通路增强FAPs在体外共培养系统中刺激MuSCs成肌的能力
为了研究Wnt/β-catenin通路对体外共培养系统中MuSCs分化的影响，使用了FAPs来源的条件培养基（CM）与MuSCs进行共培养。RT-qPCR结果显示，与未经处理的FAPs相比，经20 nM LY2090314处理的FAPs显著促进了成肌基因（MyHC、MyoD、MyoG、MRF4和MYF5）的表达。此外，LY2090314处理还显著提高了FST基因的表达。然而，用1 μM XAV-939处理的FAPs消除了FAPs对MuSCs的成肌效应，MyHC、MyoD和MyoG蛋白的表达水平下降。MyHC免疫染色显示，经20 nM LY2090314处理的FAPs的肌管融合指数达到71.46%，而1 μM XAV-939处理的仅为38.02%。
研究总结
本研究通过单核RNA测序（snRNA-seq）技术分析了延边牛骨骼肌在不同发育阶段的细胞异质性和转录特征，揭示了成纤维/脂肪生成祖细胞（FAPs）在肌内脂肪沉积中的作用及Wnt/β-catenin信号通路对FAPs成脂分化的调控机制。通过鉴定延边牛骨骼肌在两个发育阶段的8种细胞亚群，包括肌细胞、平滑肌细胞、FAPs、卫星细胞（SCs）等，发现FAPs在肌内脂肪沉积中起关键作用，表达主要Wnt配体和受体。GSK3抑制剂LY2090314通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制FAPs的成脂分化，促进肌卫星细胞（MuSCs）的自我更新和成肌分化，而Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂XAV-939则促进FAPs的成脂分化。这一研究为改善牛肉品质提供了新的理论依据和潜在靶点，有助于未来通过调控FAPs的成脂分化来提升肉品质
原文链接：https://doi.org/10.7554/eLife.92046
关于本研究中使用的snRNA-seq研究方法
在现代生物医学研究中，单细胞测序技术因其能够揭示细胞异质性和转录组多样性而受到广泛关注。然而，单细胞测序技术往往受到细胞数量和质量限制。为此，单细胞核测序技术应运而生，它通过仅对细胞核进行测序，极大地提高了样本的利用率。
而单细胞核测序技术相比于传统的单细胞测序具有明显的特点和优势。单细胞核测序能够从少量组织中提取大量的细胞核进行测序，这对于研究发育生物学、肿瘤异质性等领域具有重大意义。在本研究中，需要分析延边牛骨骼肌在不同发育阶段的细胞异质性和转录特征，而这些样本的获取不仅耗时而且成本高昂。通过使用单细胞核测序技术，能够从有限的样本中获取更多的信息，大大提高了实验的效率和成本效益。
其次，单细胞核测序技术在处理复杂组织样本时表现出独特的优势。在骨骼肌组织中，存在多种细胞类型，包括肌细胞、平滑肌细胞、成纤维/脂肪生成祖细胞（FAPs）、卫星细胞（SCs）等。这些细胞的大小、形态和核质比差异较大，使用传统的单细胞测序方法可能会导致细胞裂解偏好性，影响测序结果。而单细胞核测序技术则能够有效避免这一问题，通过直接对细胞核进行测序，获得了更为准确和全面的转录组信息。
同时，本文选用的高质量的细胞核分离方法（SHBIO 52009-10）也是单核RNA测序（snRNA-seq）成功的关键步骤。伯优（SHBIO）细胞核分离试剂盒是基于密度梯度法的创新产品，专为满足单细胞测序等高标准需求而设计。我们的试剂盒在配方上进行了精心设计，确保在分离过程中最大限度地保护细胞核的完整性，减少RNA的降解，从而为下游的测序分析提供高质量的材料。此外，密度梯度法的应用使得细胞核的分离更加精确有效，尤其是对于含有多种细胞类型的复杂样本，如骨骼肌组织，能够有效去除细胞碎片和其他杂质。
我们致力于不断创新和完善我们的产品线，以满足生物医学研究中不断变化的需求。我们相信，通过提供这样的高质量研究工具，能够支持科研人员们在单细胞测序及相关领域取得更多突破性成果，推动整个生命科学领域的发展。