常见HLA匹配的七个SARS-CoV-2抗原免疫肽组分析详解
2024-09-26 来源:本站 点击次数:1566大多数 COVID-19 疫苗可针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白产生免疫。然而，新出现的毒株中刺突蛋白的突变和 SARS-CoV-2 病毒的免疫逃避需要开发靶向范围更广的疫苗。基于这个问题，8月30日，来自澳大利亚莫纳什大学的Anthony W. Purcell教授团队在Nature Communications发表题为“Mapping the immunopeptidome of seven SARS-CoV-2 antigens across common HLA haplotypes”的相关研究成果。研究中使用质谱法来鉴定源自七种相对保守的SARS-CoV-2蛋白（N、E、Nsp1/4/5/8/9）的免疫肽，数据分析使用PEAKS Online完成。
两种实验方案鉴定SARS-CoV-2表位
用含有荧光标记的质粒转染细胞后可以对成功转染的细胞进行分类，从而有助于建立高纯度的稳定细胞系，通过扩增收集大量细胞，便于建立免疫肽组学深度覆盖数据，从而发现潜在的新生多肽。然而这种方法耗时长达2个月，且细胞培养工作繁琐。因此，作者又尝试了一种将SARS-CoV-2蛋白直接递送到细胞中的替代方法（图1）。电穿孔法将纯化重组病毒或其他蛋白质递送到哺乳动物细胞，再到收集细胞的过程仅需48小时。如果这种电转染方法可以使目标抗原蛋白成功导入抗原加工通路中，那么在发现新病原体及变异蛋白时，将极大地缩短表位发现和疫苗开发的周期。
两种实验方案鉴定SARS-CoV-2表位
图1 SARS-CoV-2表位鉴定的两种实验方案
SARS-CoV-2基因转染的BLCL呈递的HLA多肽鉴定结果
作者基于质谱法分别对稳定转染的9004和9087 BLCL 细胞系中，病毒E、N、Nsp8和Nsp9蛋白的HLA结合表位进行鉴定，数据分析使用PEAKS Online完成。平均鉴定出HLA-I类肽34164条，HLA-II类肽76863条（图2A），总共鉴定超过500,000条人类多肽序列，其中包括181条非冗余SARS-CoV-2多肽。
HLA-I类肽长度主要为9 mer，HLA-II类肽则主要分布在12-18 mer，符合预期（图2B）。值得注意的是，对于9087 BLCL，HLA I 类数据集中检测到了相对较多的长度为8氨基酸的多肽，且大多数均归属于HLA-B*08:01。据先前研究报道，HLA-B*08:01结合的8肽数量与9肽数量之比仅为0.4倍，而在本数据集中为0.8倍[1,2]。此外，单电荷母离子对于检测较短肽段尤为重要。因此，作者分析了数据集中8肽的电荷状态，发现大多数8肽母离子为单电荷，而9肽通常带双电荷，此信息未曾有研究报道。然后，作者进行了基序分析，结果显示主要结合位点与细胞系中表达的HLA-I同种异型的预期结合基序一致（图 2C）。因此，该数据集不仅鉴定到了大量新的SARS-CoV-2免疫肽，而且可作为BLCL的扩展人类免疫肽组研究数据库，特别是针对HLA-B*08:01同种异型的8肽。
HLA-I类肽长度主要为9 mer，HLA-II类肽则主要分布在12-18 mer，符合预期（图2B）。值得注意的是，对于9087 BLCL，HLA I 类数据集中检测到了相对较多的长度为8氨基酸的多肽，且大多数均归属于HLA-B*08:01。据先前研究报道，HLA-B*08:01结合的8肽数量与9肽数量之比仅为0.4倍，而在本数据集中为0.8倍[1,2]。此外，单电荷母离子对于检测较短肽段尤为重要。因此，作者分析了数据集中8肽的电荷状态，发现大多数8肽母离子为单电荷，而9肽通常带双电荷，此信息未曾有研究报道。然后，作者进行了基序分析，结果显示主要结合位点与细胞系中表达的HLA-I同种异型的预期结合基序一致（图 2C）。因此，该数据集不仅鉴定到了大量新的SARS-CoV-2免疫肽，而且可作为BLCL的扩展人类免疫肽组研究数据库，特别是针对HLA-B*08:01同种异型的8肽。
图2 病毒基因稳定转染后的BLCL抗原肽呈递结果
电穿孔直接递送SARS-CoV-2蛋白的BLCL HLA多肽鉴定
作为基因转染法的替代方案，作者通过电穿孔法分别将SARS-CoV-2的Nsp1/4/5/9和N蛋白直接递送到BLCL细胞中。HLA I类平均鉴定出10,578个长度为8-12的多肽，HLA II类平均鉴定出22,044个长度为10-20的多肽（图 3A）。由于直接递送蛋白使用的细胞量偏低，因此比基因转染法检出量少，但肽段长度分布趋势相同（图 3B）。并且9004 BLCL洗脱肽的motif与基因转染法相似（图 3C）。作者通过蛋白直接递送的方法共检测到了81种特异的SARS-CoV-2 HLA I类和II类多肽。在阴性对照的亲本细胞系中，未检测到任何病毒相关多肽。
图3 直接蛋白递送法鉴定的免疫肽
蛋白直接递送法与基因转染法结果对比
对于N蛋白，在基因转染的9004和9087 BLCL中分别鉴定到32和33条HLA肽（包含I型和II型）。蛋白直接递送的9004 BLCL中则没有鉴定到N蛋白衍生肽，在9087 BLCL中仅鉴定到10条HLA II型多肽。此差异可能是由于病毒的核壳蛋白衍生多肽更加倾向于以HLA II类分子呈递。两种方法之间Nsp9蛋白衍生多肽的呈递相似度更高，均鉴定到了具有相同9-mer核心的多肽，此外一些肽仅在基因转染细胞中检测到，一些HLA II类多肽仅在蛋白直接递送方法鉴定（图 4A）。因此可以看出，直接递送方法中外源性蛋白的引入主要参与HLA II类多肽的呈递过程，而基因转染方法则会更全面地覆盖I型和II型多肽呈递过程。针对研发时间紧迫的HLA II类抗原，可考虑使用蛋白直接递送的方法，但如果蛋白来源是细菌，则无法涵盖哺乳动物的翻译后修饰信息。基因转染方法虽然耗时长且劳动强度较大，但可提供来自目标基因的更完整的HLA I类和II类抗原信息，在新抗原的发现研究中仍是无法被完全替代的。
图4 SARS-CoV-2 衍生蛋白的HLA-I和HLA-II多肽分布
病毒抗原呈递的免疫肽组学
将鉴定到的病毒HLA肽与SARS-CoVI-2源蛋白序列比对，作者发现了在不同HLA分型和细胞系中高频出现的12个热点呈递抗原（图4B）。此外在疫苗设计时，需要尽可能排除致病抗原与人类蛋白质的任何潜在交叉反应，以避免出现自身免疫等不良影响。因此作者分析了鉴定到的HLA多肽与人类基因组的相似性，每条多肽最多允许2个氨基酸不一致，不考虑插入和缺失，最终筛选出43条与人源蛋白高度相似的肽段。
病毒多肽的翻译后修饰
在所有鉴定到的248条非冗余病毒多肽中，54条是带有修饰基团的（表1），并且氧化（M）、脱酰胺（Q,N）、脱水、乙酰化、半胱氨酸化等与已报道的HLA肽常见修饰一致[3-6]。其中，Nsp9: 32YYN(+0.98)TTKGGRF41和Nucleoprotein: 267AYN(+0.98)VTQAF276值得关注，因为它们均在基因转染的9004 BLCL的HLA-I类样品中被鉴定到，并且都有NX(S/T)基序。据报道，SARS-CoV-2核衣壳蛋白的N269位置有高达94%都是被糖基化修饰的[7]，此处的脱酰胺应该是由N糖链被切除产生的。
表1 HLA多肽的翻译后修饰汇总
与IEDB中HLA多肽的相关性分析
作者对比了IEDB中质谱法鉴定的378条SARS-CoV-2相关多肽，结果显示本研究很大程度上增加了HLA-B*08:01/B*27:05、HLA-C*01:02/C*07:01、HLA-DQA*05:01/DQB1*02:01和HLA-DRA1*01/HLA-DRB1*01:01/DRB1*03:01结合的多肽数量，并增加了两种高度流行的HLA分型A*01:01/A*01:02的结合肽数量（图5）。
图5 本研究结果与IEDB数据库对比
部分SARS-CoV-2多肽的免疫原性验证
作者选取了56条SARS-CoV-2的多肽（均不含反应性半胱氨酸）进行合成，并将其分为3组，对9名SARS-CoV-2患者的PBMC进行 T细胞活化测定，这些患者的HLA表型均与BLCL匹配。每个患者的PBMC经三组多肽分别刺激并扩增10天，然后测定细胞内细胞因子（图 6A）。对于在第 10 天对某组肽段反应明显的细胞，在第 13 天用该组中的部分肽段再次刺激（图 6B-D）。值得注意的是，在感染症状出现后72天收集的患者PBMC样品中，检测到了对源自 E、Nsp1 和 Nsp9 蛋白的特征多肽的CD4+T细胞反应（图6B）。
进一步检测到三个患者的样品对19肽N 343-361 ( DPNFKDQVILLNKHIDAYK ) 有显著反应，而具有共享氨基酸片段的 N 333-349 (YTGAIKLDDKDPNFKDQ )抗原特异性反应不明显 (图6C)。患者1、8、9的PBMC分别为感染症状出现后的第 109、210 和 12 天收集。患者1和8均未接种疫苗，患者9为接种疫苗后的突破性感染。以上结果表明，COVID-19 患者在感染后7个月内对SARS-CoV-2 N蛋白拥有持续的特异性CD4+T细胞免疫力。
此外，还检测到一名患者对pool 3肽段的CD8+T细胞反应，其PBMC采集时间为症状出现后 214 天（图6D）。然后，进一步对pool 3肽段分组测试，将反应范围缩小到3B组（N 71-85（GVPINTNSSPDDQIG）、N77-86（NSSPDDQIGY）和N77-87（NSSPDDQIGYY）），N77-86和N 77-87均预测可与HLA-A*01:01结合。
图6 SARS-CoV-2部分多肽的T细胞反应活性测定
小结
本研究通过基因转染和蛋白直接导入的方式，很大程度上提高了SARS-CoV-2七种常见非结构蛋白衍生免疫肽的质谱鉴定深度，同时也为特异性T细胞反应提供了重要实验证据。有助于深入了解SARS-CoV-2易于呈递的抗原肽，便于合理设计下一代 COVID-19 疫苗，以应对一系列新出现的SARS-CoV-2变体。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-51959-6
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参考文献
1. Gfeller, D. et al. The length distribution and multiple specificity of naturally presented HLA-I ligands. J. Immunol. 201, 3705–3716 (2018).
2. Sarkizova, S. et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nat. Biotechnol. 38, 199–209 (2020).
3. Ramarathinam, S. H., Ho, B. K., Dudek, N. L. & Purcell, A. W. HLA class II immunopeptidomics reveals that co-inherited HLA-allotypes within an extended haplotype can improve proteome coverage for immunosurveillance. Proteomics 21, e2000160 (2021).
4. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
5. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
6. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
7. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
本研究通过基因转染和蛋白直接导入的方式，很大程度上提高了SARS-CoV-2七种常见非结构蛋白衍生免疫肽的质谱鉴定深度，同时也为特异性T细胞反应提供了重要实验证据。有助于深入了解SARS-CoV-2易于呈递的抗原肽，便于合理设计下一代 COVID-19 疫苗，以应对一系列新出现的SARS-CoV-2变体。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-51959-6
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参考文献
1. Gfeller, D. et al. The length distribution and multiple specificity of naturally presented HLA-I ligands. J. Immunol. 201, 3705–3716 (2018).
2. Sarkizova, S. et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nat. Biotechnol. 38, 199–209 (2020).
3. Ramarathinam, S. H., Ho, B. K., Dudek, N. L. & Purcell, A. W. HLA class II immunopeptidomics reveals that co-inherited HLA-allotypes within an extended haplotype can improve proteome coverage for immunosurveillance. Proteomics 21, e2000160 (2021).
4. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
5. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
6. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
7. Mei, S. Immunopeptidomic analysis reveals that deamidated HLA-bound peptides arise predominantly from deglycosylated precursors. Mol. Cell Proteomics 19, 1236–1247 (2020).
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